維持β細胞身份和功能性成熟:糖尿病幹預新機制

　　文章來源：中華內分泌代謝雜誌, 2018,34(1) : 11-15

　　作者：汪啟迪

　　摘要

　　糖尿病發病機制中的關鍵原因是功能性胰島β細胞量(functional β cell mass)的丟失，無法分泌足夠的胰島素以保持機體的血糖穩態。1型糖尿病主要是免疫介導的β細胞凋亡導致的胰島素絕對缺乏，而2型糖尿病在胰島素抵抗同時，伴有不同程度的β細胞功能異常和凋亡。一系列最新研究提示，2型糖尿病的β細胞功能受損與其無法維持正常的成熟功能狀態有關，主要可以歸結為：(1)β細胞身份的丟失(loss of cell identity)，特別是那些成熟β細胞特異性轉錄因子及與功能密切相關蛋白的表達異常；(2)去分化(de-differentiation)，定義為成熟β細胞退化到祖細胞或類幹細胞狀態。β細胞功能性成熟的維持還與一群β細胞"不允許基因"(disallowed gene)的選擇性低表達密切相關。本文將介紹胰島β細胞成熟分化調控的最新進展，並融入本研究團隊在此領域的研究成果，旨在為探索糖尿病臨床幹預提供一些啟示。

　　一、2型糖尿病和β細胞的功能性成熟分化

　　近年來，糖尿病在世界範圍內呈流行趨勢。國際糖尿病聯盟(IDF)最新統計資料表明，2015年全球成人糖尿病患病率為8.8%[1]。來自中國人群的大型研究顯示，中國成人糖尿病患病率在2010年和2013年為11.6%[2]和10.9%[3]，已成為全球範圍糖尿病增長最快的地區。糖尿病發病機制中的核心關鍵是功能性胰島β細胞量(functional β cell mass)的下調，後者不僅取決於胰島β細胞絕對數目的變化(由β細胞分裂、再生和凋亡共同調節)，還受到β細胞身份(beta cell identity)和功能性成熟(functional maturation，即糖刺激胰島素分泌的能力)維持的影響[4,5,6]。β細胞身份和成熟分化狀態的維持依賴於：(1)β細胞特異性轉錄因子及功能相關基因[胰腺十二指腸同源盒1(Pdx1)、肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(MafA)、Nkx6.1、葡萄糖轉運蛋白2(Glut2)、葡萄糖激酶(GK)等]的持續表達；(2)β細胞"不允許基因"(HK1、Dlk1、AldoB等)的表達抑制；(3)基因印記的存在[6]。近期的一系列研究開拓了我們對維持β細胞成熟分化狀態重要性的認識，而成熟分化調控也成為胰島β細胞研究領域的新熱點。2012年Accili團隊首次提出了β細胞去分化是糖尿病發病機制中的關鍵因素：研究團隊在長期代謝壓力的Foxo1敲除小鼠上觀察到，β細胞特異性轉錄因子Pdx1、MafA、Nkx6.1及Glut2表達下降，β細胞回到了幼稚不成熟的細胞狀態(表達胚胎期的轉錄因子Ngn3、Oct4等)，並可向其他內分泌細胞類型如α細胞轉化[7]。相似的去分化β細胞同樣出現在2型糖尿病模型db/db和GIRKO(Glut4-CRE介導的INS受體敲除小鼠)上[8]。2016年Cinti等[9]在糖尿病患者的胰腺組織上也觀察到了胰島β細胞的去分化，並有向α和δ細胞轉分化的潛能，提示β細胞的成熟度和分化狀態丟失在2型糖尿病的病理髮病中起到了重要的作用。令人振奮的是，β細胞去分化過程是可逆的：胰島素治療在降低KATP通道異常的糖尿病小鼠的高血糖同時，使去分化的β細胞重新分化成熟，從而糾正胰島素含量的異常[10]，也為臨床治療糖尿病提供了新的思路。

　　二、維持β細胞功能性成熟的轉錄因子和標誌物

　　胚胎期β細胞對糖的反應性差，在出生後2周內才完成重要的功能性成熟過程[11,12]。β細胞功能性成熟的獲得，關鍵在於形成β細胞完備的糖刺激胰島素分泌(GSIS)的調控體系：即基礎血糖下胰島素分泌維持在一個較低的水平，而在糖刺激下胰島素可以迅速合成和分泌[13]。β細胞成熟的調控是一個非常複雜的基因調控過程，其成熟和身份的維持需要一系列β細胞特異性轉錄因子(Pdx1、Nkx6.1、NeuroD1、MafA、Islet-1)[14,15,16,17,18]、細胞信號通路(甲狀腺激素、CTGF)[19,20]和核受體ERRg[21]的參與。β細胞出生後的成熟伴隨著轉錄因子MafA表達的逐漸增加和MafB表達的逐漸下降：在初生小鼠的胰島中，增強MafA的表達能夠使β細胞迅速獲得GSIS的能力[22]；相反，MafB僅表達於胚胎和新生的α和β細胞中，在成熟β細胞中表達抑制，被認為是胚胎期β細胞成熟發育的重要調節因素[23]。Melton實驗室通過對於不同成熟時期的β細胞基因表達譜的篩選，將β細胞成熟的標誌物Ucn3的表達和糖閾值的增加作為β細胞功能性成熟的標誌[12]。Van der Meulen等[24]觀察到在正常成年小鼠胰島的外周也存在極少量Ucn3陰性的幼稚β細胞，這些Ucn3陰性的β細胞在轉錄水平和功能上均不成熟。同時，Accili團隊也篩選出了前體β細胞標誌物ALDH1A3：在去分化的胰島β細胞中ALDH1A3表達水平顯著上調。進一步分選出的ALDH1A3陽性細胞，其線粒體功能存在障礙，對葡萄糖的反應更差，並伴有成熟β細胞標誌物的減少和祖細胞標誌物的增加[25]。在各種幹預中，僅限制飲食(而非胰島素、SGLT抑制劑、羅格列酮治療)可逆轉去分化標誌物ALDH1A3在糖尿病小鼠db/db中的異常高表達[26]。

　　三、mTORC1信號通路調控β細胞功能性成熟

　　究竟是何種特定信號通路參與了出生後β細胞功能性成熟這一重要生理過程，尚無深入的研究。mTORC1為體內進化高度保守的絲蘇氨酸激酶信號通路，由mTOR調節相關蛋白(RAPTOR)、mLST8、PRAS40、DEPTOR和mTOR組成，通過感受上遊營養物質及生長因子等的信號，調控下遊真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)[27]，對細胞的生長、增殖、代謝等具有重要調節作用[28,29]。本課題組和其他研究團隊都證實mTORC1信號通路在胰島β細胞量和功能的維持中起重要作用[30,31,32,33,34,35,36,37,38]，但其是否也參與了β細胞功能性成熟的過程尚不明確，為回答這個問題，本課題組在小鼠出生後1、4、8、11 d β細胞功能成熟關鍵時間點的胰腺組化切片上，觀察到mTORC1蛋白在β細胞成熟過程中出現表達的高峰。在出生後1 d的胰腺中僅看到極少量胰島素陽性細胞表達了mTORC1下遊PS6蛋白，PS6和胰島素共染在出生後4~8 d達到了高峰，之後在出生後11 d"成熟窗口期"結尾時PS6表達又明顯下降了[39]。因此，PS6的表達高峰正好與β細胞在出生後4~8 d從不成熟向成熟GSIS過渡相吻合，從而提示mTORC1活性很有可能參與β細胞的成熟分化。為了證實這個假設，我們進一步使用Cre-loxP系統構建了胰島β細胞特異性敲除mTORC1關鍵組成蛋白Raptor的小鼠βRapKO，這也是首次在β細胞水平敲除mTORC1這個重要的分子信號通路。這些轉基因小鼠在出生後4周即出現了顯性糖尿病，並存在嚴重的胰島素分泌缺陷，在14~36周由於嚴重高血糖而死亡[39]。缺失mTORC1信號，這些敲除小鼠出生後β細胞量的擴增出現明顯異常：β細胞量和胰島素含量的減少均超過50%，這主要由於β細胞大小下降、凋亡增多和胰島素合成異常直接導致的[39]。之後發表在Nature communications的另一項研究證實，mTORC1/S6K通路在mTORC1調節β細胞大小、細胞凋亡和自噬的過程中發揮重要作用，而mTORC1/4E-BP2-eIF4E通路則參與β細胞的增殖，兩者共同參與了對β細胞量和糖穩態的維持[40]。有意思的是，我們通過對正常和βRapKO小鼠的胰島晶片分析和功能實驗，在8周敲除小鼠的β細胞中觀察到了明確的不成熟狀態[39]：(1)維持成熟β細胞的重要轉錄因子Pdx1、Nkx6.1、NeuroD1表達的下調；(2)出現類似胚胎β細胞的代謝表型，即成熟β細胞關鍵代謝因子Glut2和Pcx的下調，糖酵解通路酶Ldha、AldoB和Hk1的異常上調，ATP合成能力下降，以及糖刺激胰島素分泌的缺陷；(3)出生後與成熟密切相關的轉錄因子MafA和MafB的動態變化被打破：出現了MafA的表達下降和MafB的表達異常升高；(4)β細胞的成熟標誌物UCN3表達水平下降，而前體β細胞標誌物ALDH1A3表達的異常增高。這些不成熟表型在2周齡正常血糖的βRapKO小鼠[39]和使用胰島素泵維持出生後血糖正常的8周齡βRapKO小鼠(未發表數據)的β細胞中仍然存在，提示β細胞功能性成熟缺失是由於mTORC1信號通路下調所導致，而非繼發於敲除小鼠體內伴隨的高血糖。

　　四、β細胞功能性成熟、"不允許基因"和表觀遺傳學調控

　　β細胞功能性成熟的維持還與一群β細胞"不允許基因"(disallowed gene，相較於其他組織)的選擇性低表達密切相關[41,42]。部分"不允許基因"的再激活可見於2型糖尿病患者和糖尿病動物模型的胰島中，與β細胞糖刺激胰島素分泌缺陷相關[43,44,45]。近年來，表觀遺傳調控，包括DNA甲基化[46]、組蛋白甲基化和非編碼RNA[47,48,49]，被認為參與了β細胞成熟後"不允許基因"的持續抑制表達。我們在βRapKO小鼠胰島和使用mTORC1特異性抑制劑rapamycin的正常胰島和β細胞株的體外實驗證實，mTORC1信號通路下調可以降低甲基化轉移酶DNMT3a的蛋白翻譯水平，而後者可能通過甲基化調控影響β細胞的功能性成熟[39]。我們進一步使用甲基化DNA免疫共沉澱測序發現，不成熟的βRapKO小鼠胰島中有50%以上的β細胞"不允許基因"出現了明顯上調，且與成熟密切相關的"不允許基因"，例如HK1、Dlk1、Pdgfra、Oat、Mylk等都出現了DNA甲基化的調控[39]。在胰島β細胞成熟過程中Pdgfra的表達逐漸減弱，參與了年齡相關的β細胞增殖能力下調[50]，且Pdgfra表達的異常上調可見於2型糖尿病患者和糖尿病大鼠的胰島中[44,45]。另一個例子，HK1在β細胞和肝臟組織中特異性不表達[41]，其低表達使得β細胞能更好地感受生理水平的糖濃度(>4 mmol/L)，在MIN6細胞[51]和胰島β細胞[52]中短暫過表達HK1會使β細胞呈現糖閾值增高的不成熟表型。而Oat[53]和Mylk[54]也被證實與糖代謝和胰島素分泌有著密切關聯。雖然目前我們對很多β細胞"不允許基因"的功能和重要性仍知之甚少，但其與β細胞功能性成熟的相關性也使之開始得到越來越多的關注。

　　五、結語和展望

　　糖尿病小鼠和2型糖尿病患者的胰島β細胞中出現了β細胞身份丟失、不成熟和去分化轉分化，使得探究維持β細胞的分化成熟狀態的分子機制顯得格外重要。了解哪些信號通路或藥物及小分子化合物能夠減緩或逆轉去分化途徑或特異有效地促進功能性β細胞的成熟再生，將為糖尿病的治療提供新的策略。我們的研究證實，Raptor/mTORC1信號通路下調同時從線粒體代謝、蛋白翻譯核糖體生物合成和DNA甲基化調控三個方面影響了β細胞功能性成熟(圖1)。希望在不久的將來，有更多的促進β細胞成熟分化的信號通路被解析，通過體外誘導ES細胞或iPS細胞成熟分化成為有GSIS功能的β細胞，或促進胰島中其他內分泌細胞向成熟的β細胞轉分化，找到治療糖尿病的藥物新靶點。

　　註：Raptor/mTORC1直接調節胰島β細胞的大小和活性，從而控制β細胞量。Raptor下調從以下三個方面影響了β細胞功能性成熟。首先，降低葡萄糖的攝取和代謝(Glut2和Pcx)，減少ATP合成，通過刺激-分泌耦聯途徑影響胰島素分泌。其次，抑制β細胞蛋白翻譯起始和核糖體生物合成，影響成熟胰島素的合成和分泌囊泡的成熟。最後，通過下調DNA甲基化，異常上調成熟β細胞特異性"不允許基因"的表達(如Hk1、Dlk1、Pdgfra、Oat、Mylk等)，從而參與調控β細胞的功能性成熟(原圖出自本文作者Nat Commun，2017，8：15755的文章)

　　圖1Raptor/mTORC1在β細胞功能性成熟中的作用

　　參考文獻 （略）

　　掃碼下載雜誌官方App