自然流產(SA)小鼠模型建造方法

原型物種：人

來源：Clark經典反覆流產小鼠模型(CBA/J與DBA/2）

模式動物品系：雌性CBA/J，雄性DBA/2，雄性BALB/c小鼠

實驗分組：正常妊娠對照組，健康未妊娠對照組，RSA模型組，RSA治療組

實驗周期：6~8 weeks

建模方法

將雌性CBA/J與雄性BALB/c小鼠按2:1比例合籠交配建立正常妊娠小鼠模型，雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠按2:1比例合籠交配建立（復發性流產）RSA小鼠模型，檢出陰栓者計為妊娠第0天。

實驗共分4組：

治療組（雌性CBA/J 10隻、雄性DBA/25隻）

RSA模型組（雌性CBA/J 10隻、雄性DBA/25隻）

正常妊娠對照組 （雌性CBA/J 10隻、雄性BALB/c 5隻）

健康未妊娠對照組（雌性CBA/J 10隻）

各組從妊娠第0日開始灌胃給藥，每組10隻雌鼠。

劑量根據成人70kg臨床用藥劑量按動物體表面積換算，灌胃容積均為0.4mL/20g。正常妊娠組和RSA模型對照組給予相同體積蒸餾水，連續灌胃給藥14d，末次給藥1h後處死小鼠，取其外周血和蛻膜組織。

模型評價

流式細胞數檢測PBMCs中Th17/Treg細胞比例：

分離小鼠PBMCs後，按工作濃度加入佛波酯，Ionomycin，Monensin，37°C孵育4~6h，設同型對照管和檢測管。Fc受體阻斷劑封閉後，分別加入CD4表面抗體染色，混勻，室溫避光孵育15min後每管按操作要求先後加入固定液和破膜/溶血液，洗滌後實驗管分別加入2種配色抗體，對照管加入同型對照抗體。避光孵育後，加入洗滌劑離心棄上清，重懸細胞，24h內上機檢測。以CD4直方圖射門，以散點圖染色陽性表示Th17細胞和Treg細胞，用Cellsquest軟體獲取並分析數據。（一個樣本分為兩種染色方案，Th17：CD4-FITC、IL-17-PE；Treg：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE）

RT-PCR檢測PBMCs中FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5的表達：

分別提取各組PBMCs總RNA，並進行RNA純度和完整性鑑定；設計引物，逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參，然後進行實時螢光定量RT-PCR；採用相對定量法利用Ct計算FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5 mRNA的相對量。

組織病理學

1.HE染色觀察局部組織細胞病理結構改變：

取各組小鼠蛻膜組織，包埋石蠟切片，HE染色。

2.電鏡觀察局部組織細胞凋亡和病理結構改變：

無菌取各組小鼠蛻膜組織，加入2.5%戊二醛進行預固定，1%鋨酸進行後固定，再逐級用乙醇和丙酮進行脫水，樹脂包埋，製備成超薄切片，醋酸雙氧鈾-硝酸鉛溶液進行雙重染色，置投射電鏡下進行觀察。

3.免疫組化分析局部組織細胞因子STAT3、STAT5表達：

4.RT-PCR檢測蛻膜組織中的FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5 mRNA表達。

5.Western blot檢測蛻膜組織中的STAT3、STAT5蛋白表達

標誌因子水平

6.1ELISA檢測脫膜組織勻漿中的IL-2、IL-6。

收集各組蛻膜組織，組織勻漿後取上清進行ELISA檢測。

6.2ELISA檢測細胞因子IL-2、IL-6和TGF-β1表達：

取各小鼠血清，使用IL-2、IL-6和TGF-β1 ELISA kit，按照試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上設定標準曲線，每個標本和標準品均設3個復孔。用酶標儀讀取血清樣本的吸光度值（A），通過標準曲線計算樣本濃度值。