固體廢物 二噁英類的篩查 報告基因法(徵求意見稿)

北極星固廢網訊:北極星環保網獲悉，為貫徹《中華人民共和國環境保護法》和《中華人民共和國固體廢物汙染環境防治法》，保護環境，保障人體健康，規範固體廢物中二噁英的篩查方法，生態環境部印發《固體廢物 二噁英類的篩查 報告基因法(徵求意見稿)》，詳情如下：

 

前 言

為貫徹《中華人民共和國環境保護法》和《中華人民共和國固體廢物汙染環境防治法》，保護環境，保障人體健康，規範固體廢物中二噁英的篩查方法，制定本標準。

本標準規定了篩查固體廢物中二噁英類的報告基因法。本標準的附錄A為規範性附錄、附錄B為資料性附錄。本標準為首次發布。

本標準由環境監測司、科技標準司組織制訂。本標準起草單位：國家環境分析測試中心。

本標準驗證單位：河南省環境監測中心站、中國農業科學院、湖南省環境監測中心站、廣西壯族自治區環境保護監測中心站、四川省環境保護科學研究院和寧波市環境監測中心。

本標準生態環境部20□□年□□月□□日批准。本標準自20口□年□□月□□日起實施。

本標準由生態環境部解釋。

固體廢物 二噁英類的篩查 報告基因法

警告：操作人員應了解二噁英類分析操作的相關風險，並接受相關培訓。實驗中所使用的溶劑及標準樣品均為有毒有害化合物，其溶液配製應在通風櫃中進行，操作時應按規定要求佩戴防護器具，避免接觸皮膚和衣物。

1 適用範圍

本標準規定了篩查固體廢物中二噁英類化合物的報告基因法。本標準適用於固體廢物中二噁英類化合物的篩查。

標準溶液的檢出限和測定下限根據使用細胞的不同而異。當使用 H1L6.1c2 細胞時，標準溶液的檢出限為 0.980 pg-TEQ/ml(0.200 pg-TEQ/well)，測定下限為 1.96 pg-TEQ/ml(0.400 pg-TEQ/well)，當取樣量為 3.5 g 時，方法測定下限為 1.00 pg-TEQ/g。

2 規範性引用文件

本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用於本標準。

HJ 77.3 固體廢物 二噁英類的測定 同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質譜法

HJ/T 20 工業固體廢物採樣制樣技術規範 HJ/T 298 危險廢物鑑別技術規範

3 術語和定義

3.1 二 噁 英 類 polychlorinated dibenzodioxins (PCDDs) and polychlorinated dibenzofurans (PCDFs)

指多氯代二苯並-對-二噁英(PCDDs)和多氯代二苯並呋喃(PCDFs)的統稱。

3.2 芳香烴受體 arylhydrocarbon receptor

指一種配體激活的轉錄因子，其配體為二噁英類等多環芳烴，也可簡稱為 Ah 受體或 AhR。

3.3 報告基因 reporter gene

指一種位於啟動子下遊，編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，其表達產物可以定量測定。

3.4 二噁英應答序列 dioxin responsive element (DRE)

指位於基因上的一段鹼基序列。AhR 與配體結合後進入細胞核，與核轉錄因子接合形成複合體，DRE 可以與該複合體特異性識別並結合。

3.5 螢光素酶 luciferase

自然界中能夠產生生物螢光的酶的統稱，其中最有代表性的為螢火蟲的螢光素酶。

3.6 傳代培養 subculture

指將凍存細胞或培養細胞的一部分，接種到新鮮培養基中繼續培養的操作。

3.7 復甦 initial culture

指將凍存的細胞從凍存的容器中取出進行培養的操作。

3.8 相對發光量 relative light unit (RLU)

樣品中的二噁英與基質反應後發光，發光強度經儀器檢測後所呈現出的數值。

3.9 標準物質的檢出限 limits of detection

生物檢測法中，用標準物質製作標準曲線後，利用標準曲線計算能夠檢測出的最小標準物質的濃度。

3.10 標準物質的測定下限 limits of quantitation

生物檢測法中，用標準物質製作標準曲線後，利用標準曲線計算能夠定量的最小標準物質的濃度。

4 方法原理

利用螢光素酶轉基因重組細胞與二噁英類及芳香烴受體(AhR)結合的特性，通過測定螢光素酶活性求得樣品中二噁英類總量。該系統合成的螢光素量以及螢光強度與測試系統加入的二噁英類物質的量成正比。

5 幹擾和消除

在本方法規定的條件下，其他有機物可能會產生幹擾。可通過優化淨化步驟，例如增加硫酸處理步驟或者採用多種淨化步驟去除幹擾。

6 試劑和材料

除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的農殘級試劑。實驗用水為正己烷充分洗滌過的蒸餾水，與細胞培養相關的水必須是滅菌後的超純水。

6.1 甲醇(CH₃OH)。

6.2 丙酮(C₃H₆O)。

6.3 甲苯(C₇H₈)。

6.4 正己烷(C₆H₁₄)。

6.5 二氯甲烷(CH₂Cl₂)。

6.6 壬烷(C₉H₂₀)或癸烷(C₁₀H₂₂)。

6.7 二甲基亞碸(C₂H₆OS)(DMSO)：細胞培養級別。

6.8 乙酸乙酯(C₄H₈O₂)。

6.9 異丙醇(C₃H₈O)：分析純。

6.10 鹽酸：ρ(HCl)=1.19 g/ml，優級純。

6.11 硫酸：ρ(H2SO4)=1.84 g/ml，優級純。

6.12二噁英類多氯聯苯淋洗液(DL-PCBs)：將甲苯(6.3)、乙酸乙酯(6.8)、正己烷(6.4)按照體積比為 1:1:8 的比例配製而成的溶液。

6.13 基礎培養基：主要包括 199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12 等。主要成分是胺基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。

6.14 青黴素/鏈黴素混合溶液：3 mg/ml 青黴素和 5 mg/ml 鏈黴素的混合溶液。使用前經過濾滅菌以及內毒素測試，0°C 以下冷凍保存。

6.15 胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)：使用前在 56°C 下，經過 30 min 非動化處理，-20°C 冷凍保存。

6.16 培養基：將青黴素/鏈黴素混合溶液(6.14)、胎牛血清(6.15)、基礎培養基(6.13)等按照一定體積比配製成的細胞培養液，例如：1:10:100。

6.17 胰蛋白酶溶液(trypsin)：含量 0.25%，0°C 以下冷凍保存。

6.18 磷酸鹽緩衝溶液(PBS)：不含鈣、鎂的 PH 值為 7.6 的磷酸鹽緩衝溶液。

6.19 細胞凍存液：用於保存細胞的溶液。

用二甲基亞碸(6.7)和胎牛血清(6.15)按 1:9 體積比混合配製，亦可購買市售有證產品。

6.20 細胞裂解液：可將細胞質內蛋白完全提取出的溶液。

6.21 螢光素溶液：在螢光素酶作用下，可以發出螢光的物質的統稱。

6.22 二氧化碳(CO2)：純度≥99.99%。

6.23 液氮：純度≥99.999%。

6.24 2,3,7,8-TCDD 標準溶液：濃度為 32 pg/µl，溶劑為甲苯或者 DMSO。

6.25 無水硫酸鈉(Na₂SO4)：分析純。

380°C 加熱處理 4 h，密封保存。

6.26 氫氧化鉀(KOH)：優級純。

6.27 硝酸銀(AgNO₃)：優級純。

6.28 硅藻土(celite 545)：二氧化矽含量≥89%，平均粒徑≤125.3 µm，900℃下熱灼減率≤0.3%。

6.29 石英砂：二氧化矽含量≥98%，粒徑 100 目~40 目，鹽酸可溶率≤3.0%。

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