Nature | 先天免疫信號新型整合蛋白——N4BP1

2021-01-13 網易

　　撰文 | 靜雪

　　責編 | 兮

　　Caspase-8通過死亡受體 (包括TNFR1和Fas) 介導細胞凋亡。Fas或Fas配體 (FasL) 的突變往往會引發T淋巴細胞的凋亡異常，從而導致人類自身免疫性淋巴增生症候群 (ALPS) 。相比之下，除了ALPS，Caspase-8或其接頭FADD的突變可導致更複雜的疾病，包括對復發性病毒和細菌感染的易感性增加，以及非常早發病的炎症性腸病(VEO-IBD) 。

　　小鼠組織中FADD-或Caspase-8的缺失也會導致腸道炎症、對感染的易感性增加以及對TLR刺激的反應減弱。在某些條件下，TLR3和TLR4通過接頭蛋白TRIF激活Caspase-8，但TLR3和TLR4信號通常不會導致細胞凋亡。但是，FADD-caspase-8缺失的促炎反應背後的潛在機制仍不明確。此外，Caspase-8的哪些底物對正常的TLR反應和先天免疫來說是至關重要的仍然是未解之謎。

　　近日，史丹福大學醫學院的Alexander D. Gitlin聯合美國基因泰克公司的Vishva M. Dixit和Kim Newton在Nature上發表了一篇名為Integration of innate immune signaling by caspase-8 cleavage of N4BP1的文章，該研究發現N4BP1是細胞因子反應的有效抑制因子；N4BP1被Caspase-8切割是炎症過程中的信號整合點；並對FADD-caspase-8突變引起的免疫缺陷給出了解釋。

　　

　　為了確定TLR4信號傳導過程中caspase-8的底物，在有或沒有泛半胱天冬酶抑制劑emricasan的情況下，作者將未經處理的小鼠骨髓來源的巨噬細胞 (BMDMs) 與用TLR4激動劑脂多糖(LPS) 刺激1小時的BMDMs進行比較。質譜分析顯示，僅用LPS處理的兩種最豐富的特異性肽來自NEDD4結合蛋白1 (N4BP1) (圖1)。蛋白質印跡證實LPS處理30分鐘內增加了約54 kDa N4BP1片段的水平，這與Asp488後的切割一致。

　　

　　圖1

　　考慮到TLR3和TLR4的刺激可以激活caspase-8，作者分別用Mlkl-/-Fadd-/-和Mlkl-/-caspase-8-/-BMDMs證實N4BP1的切割確實需要FADD和caspase-8。同時，自分泌TNF的產生似乎誘導了未刺激的野生型BMDMs中N4BP1的低水平切割。此外，表達催化失活的caspase-8 (C362A) 的Mlkl-/-Casp8C362A/C362A小鼠MEFs在接受LPS刺激時，N4BP1的切割受損。以上結果表明，FADD和caspase-8的催化活性對於LPS誘導的N4BP1切割是必需的。

　　作者還發現，僅依賴接頭蛋白MyD88的TLRs (TRIF非依賴性TLR) 的激動劑，包括Pam3csk4 (TLR1/2激動劑)、R837 (TLR7激動劑) 或CpG-B DNA (TLR9激動劑) ，在刺激1小時內都無法誘導出可檢測的N4BP1切割。作者還發現，Trif-/- BMDMs細胞可響應TNF或FasL誘導的N4BP1切割，但無法響應LPS或Poly(I:C)。因此，N4BP1的切割依賴TRIF依賴性TLR和死亡受體下遊的caspase-8。

　　此外，表達異位野生型N4BP1，而不是突變型N4BP1 (D488A) 的HEK293T細胞在接受TNF處理後也可產生54 kDa的 N4BP1切割產物，並且這一切割可被emricasan或泛半胱天冬酶抑制劑Z-VAD阻斷。總的來說，這些數據表明在多個caspase-8激活受體下遊，caspase-8可切割N4BP1。

　　先前的工作將N4BP1描述為幹擾素誘導的病毒限制因子，但N4BP1是否具有其他作用尚不清楚。基於TRIF依賴性TLR誘導的N4BP1切割的有趣模式，作者發現，N4BP1課有效地抑制TRIF非依賴性TLR誘導的選定細胞因子/趨化因子反應。

　　作者還發現，N4bp1敲除BMDMs中，TLR3和TLR4誘導正常的細胞因子分泌，作者證實caspase-8對N4BP1的TRIF依賴性切割使N4BP1的細胞因子抑制功能失活(圖2)。表明，caspase-8對N4BP1的切割失活對於正常的TLR3和TLR4誘導的細胞因子產生是至關重要的。

　　

　　圖2

　　為了在體內探索以上發現，作者構建了N4bp1-/-小鼠。作者發現N4bp1-/-小鼠出現輕度、年齡依賴性炎症和免疫失調。作者使用了TLR7依賴性銀屑病模型，發現與野生型小鼠相比，N4bp1-/-小鼠出現了嚴重的銀屑病樣病變。作者還發現N4bp1-/-小鼠在TLR1/2依賴性急性膿毒性休克模型中具有高反應性。N4bp1-/-小鼠在注射Pam3csk4後24小時比野生型小鼠產生明顯更多的IL-6、TNF和CXCL1。因此，在TLR7-和TLR1/2-依賴性炎性疾病模型中，N4BP1的缺失都加重了疾病進展。

　　在體內致病感染過程中，巨噬細胞可能同時遇到TNF和TLR配體。作者的研究證實，TNF誘導caspase-8對N4BP1的切割，賦予TRIF非依賴性的TLR誘導的炎性細胞因子反應(圖3)。作者設計了表達抗切割N4BP1(D488A)的敲入小鼠。在10-12周齡時，N4bp1D488A/D488A小鼠沒有表現出明顯的器官病理學或免疫失調。最後作者得出以下結論，Caspase-8對N4BP1的切割提供了炎症過程中信號整合的關鍵臨界點，使死亡受體如TNFR1和Fas誘導切割並失活N4BP1，從而通過TRIF非依賴性TLR釋放增強的細胞因子反應(圖3)。

　　

　　圖3

　　已知TNF阻斷劑廣泛用於治療炎症性疾病，但與感染風險增加有關。作者推測，TNF阻斷可能通過阻止TNF誘導的N4BP1切割失活而降低對感染的保護作用。為了測試這種可能性，作者利用用肺炎鏈球菌鼻內感染野生型和N4bp1-/-小鼠，然後用TNFRI-Fc阻斷TNF信號。結果發現，與用不相關的抗gp120抗體處理的野生型小鼠相比，用TNFRI-Fc處理的野生型小鼠的死亡率顯著增加，N4bp1-/-小鼠即使在TNF阻斷後也基本上存活下來。這一發現與N4BP1的失活是細菌感染過程中TNF的重要功能的觀點一致；但是，這一觀察是否表明N4bp1-/-小鼠對肺炎鏈球菌的抗性增強或耐受性增加仍不清楚。

　　綜上，作者發現N4BP1被Caspase-8切割並失活。N4BP1是TRIF非依賴性TLR誘導的選定細胞因子/趨化因子反應的重要負調節因子。N4BP1不會抑制野生型巨噬細胞中TLR3或TLR4的反應，這是由N4BP1的TRIF和caspase-8的依賴性切割所致。值得注意的是，完整的N4BP1在caspase-8缺失的巨噬細胞中的持續存在削弱了它們產生強有力的細胞因子反應的能力。與TLR3或TLR4激動劑一樣，TNF也誘導N4BP1的caspase-8依賴性裂解，從而誘導TRIF非依賴性TLR產生更高水平的炎症細胞因子。總之，作者發現Caspase-8通過切割N4BP1來整合先天免疫信號。

　　https://doi.org/10.1038/s41586-020-2796-5

　　製版人：Kira

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