煤工塵肺（Coal workers』pneumoconiosis，CWP）是在生產過程中長期吸入矽塵、煤矽塵或煤塵所導致的以肺組織不可逆性纖維化為主的疾病，主要包括矽肺、煤矽肺和煤肺，是我國最嚴重的職業病之一。
由於發病機制並不完全清楚，目前尚無有效的治療方法。大量研究表明，矽塵導致的肺纖維化過程包括肺組織炎性損傷、肺組織結構破壞以及伴有基質細胞聚集的肺組織修復。其病理特徵為肺組織成纖維細胞過度增殖，多種膠原蛋白在肺組織內過多沉積。其發生發展涉及到大量炎性因子及致纖維化因子的表達以及相關基因的複雜網絡調控。
近年來，microRNA（miRNA）作為一種非編碼小RNA因其廣泛的基因調節作用引起了科學界的關注。有研究表明miRNA在炎症、組織發育與分化、細胞增殖、凋亡及組織修復過程中均發揮了重要作用，這些廣泛的生物學作用使其成為調節器官表型的關鍵分子及多種疾病的治療靶標。
目前有關miRNA與疾病之間關係的研究很多，尤其是腫瘤，如肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、結直腸癌等，此外也包括心肌梗死、心衰、慢性腎病等。但是關於miRNA在塵肺病中的表達譜及功能學研究報導較少。因此，結合我國塵肺病的發病現狀，我們進行了煤工塵肺血清miRNA的測序分析，經過生物信息學分析篩檢出煤工塵肺與對照表達差異的miRNA，並運用體內試驗及體外實驗對煤工塵肺差異表達變化一致且最顯著的miRNA優先進行了初步的功能學驗證，探討這些miRNA在矽肺病發生發展中可能的分子機制，期望能將肺纖維化基因表達調控的網絡理解提高到一個新的水平，為找出特異性的血清miRNA作為煤工塵肺輔助診斷的生物標誌物奠定理論基礎，同時也為進一步研究預防和有效治療塵肺病提供線索。
我們主要開展了兩個階段的研究：（1）煤工塵肺病人血清miRNA標誌物篩檢：即首先通過流行病學調查選擇病例和對照、SOLiD測序法篩選出差異表達的miRNA，利用miRWalk綜合資料庫對候選miRNA所調節的靶基因及信號通路進行了分析；（2）miR-149在SiO2粉塵所致肺纖維化中的功能學研究：在第一階段研究的基礎上，選擇其中一種差異表達明顯的miRNA（miR-149）進行了初步的功能學驗證。第一部分：煤工塵肺特異的血清miRNA篩檢目的：通過對CWP病人及接塵對照血清差異表達miRNA進行分析，發現影響CWP發生發展的關鍵miRNA，為提高塵肺病的早期診斷率及探索新的治療方法提供科學依據，也為進一步研究塵肺病發病機制提供線索。
方法：（1）研究對象的選擇：2010年8月通過調查問卷收集某煤礦井下接塵男性工人的年齡、職業史（工齡、工種、防護措施等）、現病史、既往史、個人史等資料，並由專業職業病體檢機構對接塵工人進行職業病體檢，拍攝高仟伏胸片及DR胸片，根據《塵肺病診斷標準》GBZ70-2009由職業病診斷醫師對研究對象進行塵肺病診斷。篩選出煤工塵肺病人27例（壹期、貳期、叄期病人各9例），對照9例，病例與對照在年齡、接塵年代、接塵工齡、工種、吸菸等方面相匹配；（2）全基因組miRNA測序：採集外周靜脈血並分離血清，同組血清等量混合，提取RNA，SOLiD測序儀檢測全基因組ncRNA表達，應用SOLiD小RNA分析系統（錯配、過濾和比對）確定已知的miRNA、新miRNA及表達水平（拷貝數）；（3）靶基因預測及信號通路分析：將測序結果與miRNA資料庫比對，篩選出與對照組相比表達變化在2倍以上的miRNA，進一步確定在所有病例組變化方向一致的miRNA，通過miRWalk綜合資料庫對篩檢出的miRNA靶基因進行預測，並對其調控的信號通路進行分析。
結果：全基因組測序法對接塵對照組、壹期、貳期、叄期CWP血清中ncRNA進行篩檢後，各組鑑定出與資料庫匹配的miRNA比例分別為39.9%、42.2%、36.4%、39.9%。以病例組與對照組比較差異大於2倍為篩選條件，壹期、貳期、叄期CWP篩選出的差異表達miRNA數量分別為32、55和39個，其中在所有病例組變化方向一致的miRNA共有5個，表達上調的有miR-25*、miR-9*；下調2倍以上的有miR-20b、miR-222、miR-149，其中以miR-25*及miR-149的變化較為顯著。文獻報導及靶基因分析顯示，這些miRNA可能調節著與細胞增殖、凋亡、炎症、基因轉錄、細胞周期及信號轉導等相關基因的表達。
結論：在病例組與接塵對照組血清中，共篩檢出5個變化方向一致的miRNA作為候選分子，其中表達明顯上調的為miR-25*、miR-9*，表達明顯下調的為miR-20b、miR-222、miR-149，這些miRNA可能調控了肺纖維化過程的關鍵信號通路。第二部分：miR-149在SiO2粉塵所致肺纖維化中的功能學研究目的：結合前期血清miRNA篩檢結果，通過體內試驗及體外實驗研究miR-149在SiO2誘導的肺纖維化中的作用。、
方法：（1）體內試驗：建立SiO2粉塵誘導的小鼠肺纖維化模型，通過qRT-PCR檢測miR-149的表達、免疫組織化學及Western blot等實驗技術觀察小鼠肺組織內miR-149及炎症因子IL-6的動態表達情況；（2）體外實驗：①ELISA法檢測研究對象血清中IL-6的表達情況；②應用A549細胞及HBE細胞構建SiO2粉塵處理的細胞模型，通過體外轉染miR-149mimics及inhibitor使其失調表達，應用qRT-PCR檢測miR-149的表達、應用Western blot及ELISA實驗觀察細胞表達IL-6的情況。
結果：（1）與對照組相比，不同期別CWP病人血清中miR-149皆表達下調，IL-6的表達未發生明顯變化（P=0.684），但是隨著疾病進展，IL-6表達呈上調趨勢；（2）在SiO2粉塵誘導的小鼠肺纖維化模型中，免疫組織化學實驗結果顯示，25g/L SiO2粉塵處理小鼠後的第1周、第2周、第4周，其肺組織中的炎症反應較為明顯。在處理第1周，與對照組相比，生理鹽水組及粉塵組有多量的炎症細胞浸潤；在第2周，生理鹽水組的炎症反應逐漸恢復，在第4周時炎症已基本消失，但是粉塵組的炎症反應一直持續，且較重，到第4周時，肺組織內肺泡壁增厚，肺泡結構塌陷；Real-time PCR及Western blot實驗分別證實SiO2粉塵處理後的各時間點miR-149表達都明顯下調（P<0.000），而IL-6表達明顯上調；（3）在粉塵處理的細胞模型中，SiO2粉塵可明顯導致A549及HBE細胞凋亡增加，且A549細胞比HBE細胞更加敏感，用不同濃度SiO2粉塵處理細胞後其表達IL-6的水平明顯上調，存在明顯劑量效應關係，而A549細胞除了具有劑量效應關係外，隨著SiO2粉塵處理時間的延長，IL-6的表達水平也逐漸增加，還呈現出時間效應關係；用50μg/ml SiO2粉塵處理A549細胞24h及150μg/mlSiO2粉塵處理HBE細胞12h後，HBE細胞內miR-149的下調非常明顯，粉塵處理幾乎完全抑制了miR-149的表達（P<0.000），而在A549細胞內miR-149的變化未發現統計學差異，但是可見到miR-149也呈下調趨勢（P=0.234）；A549細胞轉染miR-149相似劑後使IL-6的表達下調，而轉染抑制劑後上調了IL-6的表達水平。
結論：通過體內試驗及體外實驗我們發現：（1） SiO2粉塵處理可明顯導致小鼠肺組織的炎症反應；（2） miR-149的下調及IL-6的上調可能參與了SiO2粉塵處理後的炎症、肺纖維化等相關過程；（3） miR-149可以負調控A549細胞表達IL-6的水平。