論文標題：Direct-seq: programmed gRNA scaffold for streamlined scRNA-seq in CRISPR screen
期刊：Genome Biology
作者：Qingkai Song, Ke Ni et.al
發表時間：2020/06/08
數字識別碼：10.1186/s13059-020-02044-w
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基於CRISPR基因編輯的正向遺傳篩選技術已經廣泛應用於「表型（phenotype）-基因型（genotype）」的鑑定研究，常見的研究類型包括鑑定與細胞增殖相關essential gene的負選擇實驗、與細胞獲得抗藥抗殺傷能力相關的正選擇實驗等。其基本原理是，在遺傳篩選的起點和終點，細胞群體中 gRNA的種類和頻率會發生富集或丟失。由於gRNA本身指代了細胞的基因型，所以研究人員可以據此來推測表型與基因型的對應關係。
但是，這種對應關係是存在局限性的。第一，根據分子生物學的中心法則，遺傳信息首先要從DNA傳遞到RNA，再翻譯為蛋白質，並進一步形成獨特的細胞表型。然而在目前的研究策略中，基因的RNA表達譜（gene expression profile）這一重要中間層面的信息是完全缺失的。第二，細胞異質性是近年來生物學研究的重點與熱點問題。在對篩選終點的細胞群進行分析時，儘管它們呈現出類似的表型，然而它們在分子水平上的異質性是不明確的。
西湖大學近期在開放獲取期刊Genome Biology上發表了一項研究成果Direct-seq，該研究開發了一種將CRISPR遺傳篩選與單細胞RNA-seq結合的新技術，通過改造gRNA序列，在單細胞水平將細胞的「基因型-基因表達譜-表型」關聯起來，從而克服了上述兩點局限性。該研究由該校生命科學學院馬麗佳實驗室完成，該校即將入學的2020級博士研究生宋慶凱、博士後倪科、劉敏博士為並列第一作者。
圖1
與之前已經報導的策略不同，Direct-seq在gRNA scaffold序列中加入了一段可以直接被poly(dT)反轉錄引物高效結合的捕獲序列，使得gRNA在細胞中產生的轉錄本既可以被Cas9結合，實現基因組編輯功能；同時又可以像其他內源表達的mRNA一樣，在RNA-seq或單細胞RNA-seq實驗中作為轉錄本的一部分被鑑定。由於只需要對gRNA序列進行簡單改造，Direct-seq對於用戶使用非常友好。更重要的是，改造後的gRNA scaffold既不影響其本身基因編輯的效率，又可以兼容各類使用poly(dT)作為反轉錄引物的單細胞RNA-seq建庫流程以及商業化平臺，包括10x Genomics，Fluidigm C1，DNBeLab C4等。
Direct-seq所採用的捕獲序列是一段由A、G兩種鹼基組成的混合序列（簡稱「8A8G」），模擬了內源基因轉錄本的poly(A)尾巴。這種混合捕獲序列既有與反轉錄引物的結合能力，又避免了與Poly(A) Binding Protein結合帶來的潛在負面影響。根據實驗需要，捕獲序列可以添加在gRNA scaffold的Tetraloop, Loop2和Tail三個位置。因此，即使Tetraloop和Loop2被其他aptamer佔用（如SAM CRISPR激活系統等），也不影響捕獲序列的使用。
圖2
文章同時提供了Direct-seq兼容10x RNA-seq 3』kit，10x RNA-seq 5』 kit和Fluidigm C1/SMART-seq的參考實驗流程。據文章報導，在一個使用了10x RNA-seq 3』 v3試劑盒的測試中，由於作者在文庫構建過程中使用了巢式PCR特異性富集了gRNA轉錄本，Direct-seq可以在99.4%的細胞中鑑定出gRNA轉錄本，在捕獲效率上甚至好於10x試劑盒本身提供的基於Featured Barcode的技術。
招募令
西湖大學馬麗佳實驗室關注基因編輯和組學技術開發與臨床應用。目前有博士後名額開放申請。
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圖3
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摘要：CRISPR-based genome perturbation provides a new avenue to conveniently change DNA sequences, transcription, and epigenetic modifications in genetic screens. However, it remains challenging to assay the complex molecular readouts after perturbation at high resolution and at scale. By introducing an A/G mixed capture sequence into the gRNA scaffold, we demonstrate that gRNA transcripts could be directly reverse transcribed by poly (dT) primer together with the endogenous mRNA, followed by high-content molecular phenotyping in scRNA-seq (Direct-seq). With this method, the CRISPR perturbation and its transcriptional readouts can be profiled together in a streamlined workflow.
（來源：科學網）
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