原文以 Direct-seq: programmed gRNA scaffold for streamlined scRNA-seq in CRISPR screen 為標題發布在 Genome Biology 期刊
基於CRISPR基因編輯的正向遺傳篩選技術已經廣泛應用於「表型（phenotype）-基因型（genotype）」的鑑定研究，常見的研究類型包括鑑定與細胞增殖相關essential gene的負選擇實驗、與細胞獲得抗藥抗殺傷能力相關的正選擇實驗等。其基本原理是，在遺傳篩選的起點和終點，細胞群體中 gRNA的種類和頻率會發生富集或丟失。由於gRNA本身指代了細胞的基因型，所以研究人員可以據此來推測表型與基因型的對應關係。
但是，這種對應關係是存在局限性的。第一，根據分子生物學的中心法則，遺傳信息首先要從DNA傳遞到RNA，再翻譯為蛋白質，並進一步形成獨特的細胞表型。然而在目前的研究策略中，基因的RNA表達譜（gene expression profile）這一重要中間層面的信息是完全缺失的。第二，細胞異質性是近年來生物學研究的重點與熱點問題。在對篩選終點的細胞群進行分析時，儘管它們呈現出類似的表型，然而它們在分子水平上的異質性是不明確的。
西湖大學近期在開放獲取期刊Genome Biology 上發表了一項研究成果Direct-seq，該研究開發了一種將CRISPR遺傳篩選與單細胞RNA-seq結合的新技術，通過改造gRNA序列，在單細胞水平將細胞的「基因型-基因表達譜-表型」關聯起來，從而克服了上述兩點局限性。該研究由該校生命科學學院馬麗佳實驗室完成，該校即將入學的2020級博士研究生宋慶凱、博士後倪科、劉敏博士為並列第一作者。
與之前已經報導的策略不同，Direct-seq在gRNA scaffold序列中加入了一段可以直接被poly(dT)反轉錄引物高效結合的捕獲序列，使得gRNA在細胞中產生的轉錄本既可以被Cas9結合，實現基因組編輯功能；同時又可以像其他內源表達的mRNA一樣，在RNA-seq或單細胞RNA-seq實驗中作為轉錄本的一部分被鑑定。由於只需要對gRNA序列進行簡單改造，Direct-seq對於用戶使用非常友好。更重要的是，改造後的gRNA scaffold既不影響其本身基因編輯的效率，又可以兼容各類使用poly(dT)作為反轉錄引物的單細胞RNA-seq建庫流程以及商業化平臺，包括10x Genomics，Fluidigm C1，DNBeLab C4等。
Direct-seq所採用的捕獲序列是一段由A、G兩種鹼基組成的混合序列（簡稱「8A8G」），模擬了內源基因轉錄本的poly(A)尾巴。這種混合捕獲序列既有與反轉錄引物的結合能力，又避免了與Poly(A) Binding Protein結合帶來的潛在負面影響。根據實驗需要，捕獲序列可以添加在gRNA scaffold的Tetraloop, Loop2和Tail三個位置。因此，即使Tetraloop和Loop2被其他aptamer佔用（如SAM CRISPR激活系統等），也不影響捕獲序列的使用。
文章同時提供了Direct-seq兼容10x RNA-seq 3』 kit，10x RNA-seq 5』 kit和Fluidigm C1/SMART-seq的參考實驗流程。據文章報導，在一個使用了10x RNA-seq 3』 v3試劑盒的測試中，由於作者在文庫構建過程中使用了巢式PCR特異性富集了gRNA轉錄本，Direct-seq可以在99.4%的細胞中鑑定出gRNA轉錄本，在捕獲效率上甚至好於10x試劑盒本身提供的基於Featured Barcode的技術。
Genome Biology
doi:10.1186/s13059-020-02044-w