流式細胞儀檢測外周血樹突狀細胞

2020-11-24 生物谷
概述

樹突狀細胞（DC）的主要功能是吸收抗原，進行加工，並向T淋巴細胞呈遞。其它抗原呈遞細胞也有此功能，如B淋巴細胞和單核細胞。但是，與其它細胞不同的是，DC細胞具有誘導初發免疫反應的獨特功能，例如，可以活化處女T細胞（Naive T cell）。DC細胞存在於外周淋巴組織中，已在血液和非淋巴器官中發現了不同類型的DC細胞，並被認為是淋巴組織中細胞的前體。
由於血液和組織中DC細胞含量少，且缺乏特異的DC標記物，所以DC細胞的研究非常困難。因此，關於DC細胞的了解主要來自於通過密度梯度離心、培養、和/或陰性選擇富集後的DC細胞的研究。這些過程利用了DC細胞的密度和黏附特徵，和在一定細胞因子條件下的選擇性生長，或缺乏淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的系列標記物的表達。但是，這些方法中DC細胞的產率和純度較低，且費時費力。而且，這些操作可以影響細胞的功能，並且無法做DC細胞含量的定量分析。
最近的報告發現在活化DC細胞和血液或淋巴細胞分離培養的DC細胞表面CD83和CMRF-44高表達。CD83和CMRF-44可以作為DC細胞的活化標誌物，但在體內或未處理的細胞上沒有特徵性表達，或表達水平很低。在對新鮮分離的DC細胞的研究中，發現IL-3Ra在淋巴器官的DC細胞上有特異表達。從人類外周淋巴組織中分離的單個核細胞中主要是此類DC細胞。IL-3Ra（CD123）抗體可以用來進行免疫磁珠分選，從外周淋巴組織製備的單個核細胞樣本中，將CD123+ DC細胞進行200倍富集。CD123抗體還可以用來做免疫組化分析，特異識別濾泡外T細胞富集區的CD123+ DC。在外周血中也有CD123+ DC細胞，與以前所說的CD11c- DC細胞和CD33dimCD14-CD16- DC細胞是同一類細胞。
由於缺乏DC特異性標記物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一類細胞。DC細胞既可以由成熟的外周血單核細胞生成，也可以由未分離的CD34+幹祖

細胞經GM-CSF和TNF-a培養得到。使用CD123抗體，發現有一群CD34+ DC樣幼稚細胞。這群細胞與CD34+幹祖細胞的區別是可以發育成Langerhan細胞樣DC。因此，根據CD123強染，可以識別出一類人類DC細胞，它是不同組織間DC細胞的連接橋梁。
在外周淋巴組織中還發現另一個DC亞群，與CD123+ DC不同的是，其表型為CD11c+HLA-DR+LINdim/-。與CD123+ DC相反，這群DC細胞位於生發中心。在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/- DC細胞，與CD33brightCD14dimCD16- DC細胞是同一類細胞。
由此可見，DC系統由多種細胞類型構成，發育途徑不一。但是，目前對這些細胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理條件下如何受調控等方面仍缺乏了解。CD123+ DC和CD11c+ DC細胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它們可能有不同的功能。近年來的研究主要集中在使用DC細胞進行抗腫瘤和抗感染治療方面。不同報導證實，這有可能抑制腫瘤生長。
使用這些新的DC標記物建立起來的檢測系統，可以幫助對新鮮外周血新鮮中的兩類不同的DC細胞進行定量檢測，同時可以加以分離。實驗方法採用三色或四色流式細胞儀分析，檢測速度快，樣本用量少，可以用來輔助研究在病理和生理條件下，DC在免疫調控中作用。

檢測原理和用具

檢測原理：
本實驗目的是從外周血中檢測兩種類型的DC細胞：CD123+ DC（Anti-IL-3Ra+）和CD11c+ DC。CD11c和CD123並不是DC特異的標誌物。兩類細胞均HLA-DR高表達，單核細胞、淋巴細胞和NK細胞的系列標記物弱表達。因此使用單一螢光標記的LIN cocktail（LIN1）抗體將DC細胞區分出來。LIN1抗體包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。
另外，本實驗還可以區分嗜鹼粒細胞。嗜鹼粒細胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。使用HLA-DR可以區分嗜鹼粒細胞和CD123+ DC細胞。

細胞來源：
樣本使用EDTA、ACD或肝素鈉抗凝全血，或分離的外周血單個核細胞（PBMC）。樣本採集後24小時內檢測。

試劑：

1. 檢測DC細胞用的BDIS螢光標記的單克隆抗體。
四色分析：
LIN1 FITC：貨號340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56
CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號340545
Anti-HLA-DR PerCP：貨號347364
CD11c APC：貨號340544
Mouse IgG1 PE：貨號349043
Mouse IgG2a APC：貨號340473
三色分析：
LIN1 FITC：貨號340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56
CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號340545
CD11c PE：貨號347637
Anti-HLA-DR PerCP：貨號347364
Mouse IgG1 PE：貨號349043
Mouse IgG2a PE：貨號349053
2. FACS Lysing Solution（10X）：FACS溶血素，貨號349202，用去離子水1：10稀釋
3. 洗液：PBS緩衝液
4. 1X PBS配製的1%多聚甲醛

設備用具：
1. EDTA、ACD或肝素鈉真空採血管
2. 12´75mm FALCON試管
3. 振蕩混勻器
4. FACS流式細胞儀
5. 離心機
6. 微量加樣器

全血樣本螢光抗體染色步驟：
1. 按照下表在各管中加入適量抗體；


FITC PE PerCP APC
4-Color 四色分析
Tube 1Tube 2LIN1 20uLLIN1 20uL CD123 5u（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1 Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL CD11c 5uLMouse IgG2a
3-Color 三色分析
Tube 1Tube 2Tube 3Tube 4 LIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uL CD123 5uL（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1CD11c 5uLMouse IgG2a Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL

2. 每管加入100uL全血，振蕩混勻，室溫暗處反應15分鐘；
3. 加入2mL FACS溶血劑，振蕩混勻，室溫暗處放置10分鐘；
4. 300xg離心5分鐘，棄上清；
5. 振蕩混勻，加入1mL洗液；
6. 300xg離心5分鐘，棄上清；
7. 振蕩混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；
8. 2-8°C暗處保存，24小時內上機分析

PBMC樣本螢光抗體染色步驟：
1. 按照上表在各管中加入適量抗體；
2. 每管加入50uL全血，振蕩混勻，暗處冰浴反應25分鐘；
3. 輕輕混勻，加入1mL洗液；
4. 300xg離心5分鐘，棄上清；
5. 輕輕混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；
6. 2-8°C暗處保存，24小時內上機分析

數據獲取：
1. 使用CaliBRITE微球，做FACSComp，調整PMT電壓和螢光補償，檢查儀器靈敏度；


2. 上樣：使用CELLQuest軟體，獲取50,000個細胞，用FSC設閾值，排除碎片幹擾；
3. 使用CELLQuest軟體分析結果

相關焦點

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    流式細胞術與流式細胞儀的概念　　流式細胞術(flow cytometry , FCM)：是一種定量分析技術，是指利用流式細胞儀檢測細胞特異性標記螢光信號而測定細胞的多種生物物理性質的方法，同時也是一項可以把具有某相同螢光信號特性的某些細胞亞群從多細胞群體中分離和富集出來的細胞分析技術。
  • 流式細胞儀
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    流式細胞術檢測的對象是呈獨立狀態懸浮於液體中的細胞，不能直接檢測組織塊中的細胞，必須先用各種方法將臟器或者組織製備成為單細胞懸液，然後標記上螢光素偶聯抗體，才能夠被流式細胞儀檢測；流式細胞術可以定量檢測樣品細胞的物理化學特徵，其定量是以光信號為基礎的，通過分析接收到的雷射照射到細胞後的散射光信號和螢光信號完成定量分析。
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  • 簡單介紹流式細胞儀
    流式細胞儀就是進行流式細胞分析的儀器，它集電子技術、計算機技術、雷射技術、流體理論於一體，是一種非常先進的檢測儀器，被譽為試驗室的「CT」。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩衝液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。　　流式細胞儀通常以雷射作為發光源。經過聚焦整形後的光束，垂直照射在樣品流上，被螢光染色的細胞在雷射束的照射下，產生散射光和激發螢光。
  • 流式細胞儀主要技術指標
    1．流式細胞儀的分析速度：一般流式細胞儀每秒檢測10002．流式細胞儀的螢光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上<600個螢光分子,3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細胞的大小
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    2019年，唯公科技研發的Easycell系列流式細胞儀也將獲證上市。此外，博奧生物、競天生物等國產廠商也於近年紛紛發布流式細胞儀產品，可見流式細胞儀市場生機勃勃。　　如今國內流式細胞儀廠商近30家，流式細胞儀技術不斷發展，儀器不斷小型化到微流控，融合顯微成像技術，未來應用前景十分廣闊，可以滿足更多用戶的需求。
  • 流式細胞儀知識大盤點
    1934年，Moldavan使懸浮的紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來。這就是流式細胞儀的雛形。1965年，Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數同時測量未染色細胞，給出細胞中核酸的含量和細胞大小。奠定了多參數流式細胞測量的基礎。
  • 公衛·科普 | 淋巴細胞亞群檢測的臨床意義
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  • 技術專家眼中流式細胞儀的「用武之地」
    三位技術專家分別為艾森生物流式細胞儀全球支持經理Garret Guenther，賽默飛世爾抗體、免疫分析、蛋白質和細胞分析副總裁兼總經理Dara Grantham Wright和伯樂實驗室細胞生物學全球應用及協作經理Yasha Talaga。問題一：流式細胞儀作為研究工具不斷發展。在實驗室外，流式細胞儀在哪些方面做出了重要貢獻？
  • 非成像式流式細胞儀的發展與應用
    流式細胞儀（Flow Cytometer）是集雷射技術、光電檢測技術、細胞螢光化學技術、單克隆抗體技術以及計算機技術於一體的新型高科技儀器。它能夠高效檢測細胞大小、粒度、表面積等細胞結構參數和細胞表面 / 胞質 / 核的特異性抗原、細胞內細胞因子、酶活性、Ca2+、細胞活性等細胞功能參數， 同時還具有細胞分選和計數能力。
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