宏基因組測序技術的出現讓我們能夠了解不同環境中微生物組的組成，然而僅僅依靠宏基因組測序技術無法解決所有問題，比如，這些微生物究竟吃什麼？會產生什麼代謝物？如何與其它微生物互作？要回答這些問題，我們必須在實驗室條件下分離並培養出這些微生物。遺憾的是有大量通過測序被鑑定出的微生物我們至今仍然無法成功培養。那麼，有哪些要素是在培養新的微生物時要注意的呢？有什麼新的技術方法可以幫助我們培養微生物嗎？今天，我們特別編譯了最近發表在 Nature 雜誌上的關於如何分離並培養微生物的文章，希望本文能夠為相關人士和讀者帶來一些啟發和幫助。
每一位進入 Yoichi Kamagata 的實驗室，期望培養出有趣微生物的研究者都要經歷這樣一個開始：他們會被要求先嘗試培養 Oscillospira guilliermondii，這是一種在牛羊胃中發現但從未在實驗室條件下被成功培養的微生物。Kamagata 是位於日本筑波的產業技術綜合研究所 （AIST）的微生物學家，十幾年來，他一直痴迷於這種杆狀微生物。這種微生物的大小是著名的腸道侵入者——大腸桿菌大小的十倍甚至十倍以上，而且它們看起來似乎只在食草動物體中茁壯生長。Kamagata 團隊中的工程師和微生物學家 Masaru Nobu 惋惜道：「目前為止，沒有人成功。」 Oscillospira guilliermondii 並不是唯一一種沒有被培養出來的微生物，實際上絕大多數微生物都未被培養出來。微生物「暗物質」，也就是
這些未知的微生物可能具有有用的酶、新的抗菌素和其它的新物質。雖然現代宏基因組學技術能夠一次性對群落中所有微生物的 DNA 進行測序，從而展示不同環境下的微生物組成，但是這種技術依然無法幫助研究人員解答關於微生物的基本問題，比如，
它們吃什麼？它們會產生哪些代謝物？它們在環境中如何與其他微生物相互作用？想要找到這些問題的答案，微生物學家們必須在實驗室中先分離再培養這些生物。這可能是個棘手的事。
一些微生物長得非常慢，對培養環境有著苛刻的需求，或者可能只在某些特定微生物存在的情況下生長。一些科學家採取了無靶向的方法，對這些微生物採取的策略是任何在其中生長的微生物都可能是有趣的；另一些人則瞄準了那些他們想要了解更多的特定的微生物。無論採用哪種方法，要培養一些其他人之前沒有培養出的微生物，都需要毅力、耐心和運氣。「相信自己可以在不培養出微生物的情況下來研究它們，是錯誤的觀念。」法國馬賽地中海大學醫院感染研究所主任 Didier Raoult 說。1983 年，Raoult 就開始了他的探索，當時他還是個「年輕人」。他決定要研究一類名為立克次體（Rickettsia）的微生物，儘管這種微生物早已因難以分離和培養而聲名遠揚，但是他還是想要研究它。他的學生也擁有同樣的精神，一些人甚至在實驗室裡排便，以便能夠快速地把樣品放入無氧條件中，來促進這些有趣的微生物生長。雖然他們仍沒有培養出他們想要的立克次體，但是他們的奉獻至少揭示了一個新菌種——Faecalibacterium timonensis，並且使得培養其它的微生物成為可能——為在實驗室條件下培養一系列對氧氣敏感的微生物打開了大門。Raoult 還使用來自患者或是其他志願者的樣本進行了更為廣泛、常規的搜索。他使用的方法被稱為培養組學（culturomics ）1，該方法結合了能夠提供不同培養條件的自動化液體處理技術，並會通過質譜和 rRNA基因測序來確定生長的微生物。Raoult 預估目前為止已經能在實驗室條件下培養出 700 多種微生物，這些微生物主要是來自人體腸道。Raoult 說，事實上，他實驗室最大的挑戰之一，是為這些新菌種命名並作出描述。這個團隊常常選擇用於致敬其他研究者、反映糞便樣本供體的疾病或是強調研究所地點的名字。比如，最近的一些研究涉及一個以城市馬賽 Massilia（Marseilles 的古名2）命名的杆狀細菌——Gordonibacter massiliensis；又比如另一個名為 Prevotella marseillensis 的細菌，它來自一個住在馬賽且患有艱難梭菌（Clostridium difficile）感染的供體3。像 Raoult 這樣的研究者一直嘗試在實驗室中找到適合新的微生物生長的條件，因此，他們常常會模擬自然環境。但是 Slava Epstein，麻薩諸塞州波士頓東北大學的微生物學家，則更進了一步。他說：「我們為什麼要模擬呢？我們直接在自然中培養這些生物。」Epstein 的團隊設計了多種設備，使得研究者們能夠在天然土壤或沉積物中培養純淨的微生物。一個相對便宜的設備是分離晶片（isolation chip），也叫 ichip，是由一個微量移液器的尖頭製成的4。研究人員在每個小孔中加入用融化的瓊脂稀釋的微生物樣本，以保證每個孔中能只含有一種或幾種原始微生物。而架子兩側的半滲透樹脂膜使得營養素和其他物質能夠從周圍環境進入到小孔內，但是不允許其他微生物的進入。通常情況，這個團隊會收集一桶土壤，然後按照上述方法使用 ichip，接著他們就可以培育他們的微生物了。當然，他們偶爾也會把 ichip 放置在自然環境中，但是這可能會受到來自狗和其它野生生物的幹擾。Epstein 說：「我們最討厭的就是螃蟹，因為它們有時候會用鉗子戳破裝置的膜。」2016 年，Epstein 團隊的 Brittany Berdy 在格陵蘭島西北海岸搭上了一架飛往圖勒空軍基地的軍機，去找尋能夠適應極端環境的微生物。她去了基地附近一個未命名的湖泊，並在寒冷的湖水中放置了 ichip，然後在幾周後返程取回了它們。「當時我們已經在北方了，但是你得接著再往北才能看到北極光。」Berdy 回憶道，她現在在麻薩諸塞州劍橋市的布羅德學院。回到波士頓後，Berdy 試圖使用不同濃度的不同物質來模擬湖中的條件。最棘手的部分是，模擬湖水 10℃ 的溫度——對於水浴來說太冷了，對於冷藏室來說過暖了。不過，該團隊最後成功了，他們使用了一個冰箱，並把溫度調到最高，然後半開著冰箱門。諸如 Berdy、Epstein 和 Raoult 這樣的研究者並不確定他們能從他們的培養物中獲得什麼，但是另一些研究者常常在尋找一些特定的東西。比如，田納西州的橡樹嶺國家實驗室的微生物學家 Mircea Podar 對不同的Saccharibacteria（過去被稱為 TM7）非常感興趣，這是人體微生物組中的一部分，直到最近才在實驗室中培養出來。1996 年，通過對泥沼樣本的測序，而不是通過培養，鑑定出了 Saccharibacteria 5。儘管在口腔微生物組中這一類微生物並非特別豐富，但是它們的數量會隨著特定疾病（包括牙周病）而變化，這表明這類細菌對健康有一定的影響。人的腸道中，貓、狗和海豚的口腔中，以及土壤、沉積物和汙水中都發現了這類細菌。「它們幾乎哪都有。」Podar 說。20 世紀 10 年代初期，Podar 設計了一個分離 Saccharibacteria 的方案：利用微生物的基因組，也就是通過單細胞測序來預測哪些蛋白質會出現在細胞表面，而後製造針對這些蛋白的抗體。接著，研究者們就可以利用被螢光素標記的抗體來標記微生物，然後可以再利用流式細胞儀把目標微生物從唾液樣本中分離出來。雖然參與這個項目的首位博士後 James Campbell，利用這種方法獲取了一些含有 Saccharibacteria 的培養物，但是直到幾年前，也就是 2014 年 Karissa Cross 接手這個項目後，這個團隊才算是真正迎來了成功。「這太難了，有太多次我們覺得這幾乎不可能發生。」Cross 回憶道，現在她是田納西州納什維爾的範德比爾特大學的一位博士後。她嘗試了液體培養基、固體培養基和巧克力瓊脂（用溶解的血紅細胞製成）等方法。「製備培養基就需要很多天。」然而結果常常無一奏效。2015 年，其他研究者報導了一個重要的線索：Saccharibacteria 無法獨立存活6。這些微小的球狀細菌，直徑只有 200~300 納米，需要來自放線菌門的宿主。這意味著在試圖分離 Saccharibacteria 的過程中，Podar 的團隊無意間忽略了一個關鍵的搭檔。最終，在 2018 年夏天，Cross 從她的一個聯合培養物（不止含有 Saccharibacteria，也可能含有一個新的菌科）中獲得了與 Saccharibacteria 匹配的 DNA 測序結果7。這是她研究生生涯中最重要的發現時刻，她說。她給 Podar 發郵件：「我覺得我們發現它了。」幾秒後，她就聽到走廊裡 Podar 的腳步聲。然後，他們擊掌慶祝。Jörg Overmann 說，在餵養挑剔的微生物時細節很重要。有時候，標準培養基中提供的胺基酸和糖類的「自助餐」也許並不是正確的方法，相反，降低營養素的濃度可以阻礙快速生長的微生物的生長，從而給長得慢的那些微生物留下生長的時間。Overmann 是一位微生物學家，擔任布倫施威格州萊布尼茨研究所（DSMZ-German）的科學主任。物理生長基質也很重要。Overmann 的團隊有時會在液體培養基中懸掛一塊固體——如不鏽鋼或玻璃——為生物膜形成提供基質。「我們得到了完全不同於瓊脂板上得到的東西。」他說。在一個使用這種技術處理的新鮮水樣和土壤樣本的研究中，研究小組捕獲了十多種以前從未培養過的細菌，其中包括至少五種新細菌8。Kamagata 的團隊則利用生物反應器來維持營養素的供應並移除廢棄物。他說，把整體營養素維持在一個低水平可以更好地反映目標生物的適宜生長條件。研究人員和他們的同事們第一次在反應器內懸掛了一個聚氨酯海綿（像廚房的海綿）來培養一種由名為 Asgard archaea 進化而來的深海古細菌。要想知道從哪裡開始，研究人員可以查閱 BacDive 的資料庫，其中羅列了來自 34 個細菌門和 3 個古細菌門的超過 80,000 株培養菌株的特性和培養條件。關於遺傳學信息，德國弗裡德裡希·席勒大學耶拿分校微生物學家 Christian Jogler 說：「如果有的話，也能夠提供線索。」但是 Jogler 警告說，即便是最普通的操作也會造成影響。Jogler 的團隊沒有依賴於如 Milli-Q 這樣很多實驗室都在使用的超純水系統，而是通過二次蒸餾法來製造純淨水。他說，
Milli-Q 可能會含有阻礙某些培養物生長的化學物質。此外，他還補充說，通常作為膠凝劑的瓊脂也可能會抑制生長，所以有時他們的團隊會用結冷膠等替代。Kamagata 的團隊發現，甚至連製備瓊脂的方式可能都很重要。當
瓊脂與磷酸鹽一同經過高溫殺菌時，會產生過氧化氫從而阻礙某些微生物生長。單獨對這些組分進行高溫殺菌可以解決這個問題，這也讓這個團隊培養出先前未培養出的微生物10。當然，最為關鍵的還是耐心。在耗時超過 12 年後，Kamagata 和他的同事們終於培養出一種古細菌，暫名為 Prometheoarchaeum syntrophicum。不過，只要微生物學家一旦成功培養出某種微生物，之後這個微生物就能夠快速生長。Epstein 把這個過程稱為「馴化」。他認為，在最初的、弱勢的生長周期內，一些微生物的表觀基因組（DNA 上控制基因表達的分子標記）會發生變化，以適應實驗條件。之後，它們會生長得更快。現在，Epstein 正在開發新技術以進行原位分離和培養新的微生物。他把這些設備稱為 Gullivers，為了紀念 Jonathan Swift 在 1726 年發表的書籍 Gulliver『s Travel 中的冒險家。Gullivers 是一些小盒子，其中裝滿無菌膠體，表面是半滲透膜（就像 ichip 一樣），可以讓營養素和信號物質擴散進去。這個裝置上有一個直徑為 1mm 的單向孔，從而只允許一個單獨的微生物從環境中進入。這個微生物會堵住入口，但是它的子代將會定殖在盒子中的膠體中並形成菌落。Epstein 說，最終，他可能不需要打開甚至無需取回 Gulliver 就能夠從中得到結果。他暢想，未來，納米傳感器會收集並傳回數據，包括氧氣或二氧化碳水平、信號物質或抗生素的產生。他開玩笑說，在把這個設備丟到像北冰洋的深度後，研究人員就可以輕鬆地去度假，而結果會自己不斷湧現。接下來的幾個月中，Epstein 計劃在埃利伯斯火山（南極的一座活火山）中測試 Gullivers。但是他的最終目標遠不止地球，而是把這些設備分散到可能存在生命的地方，比如火星或是木星的衛星木衛二。時間會告訴我們，這些地方是不是存在微生物。與此同時，地球上豐富的微生物也足夠研究人員忙了。Roault 說，
有了適當的技術，最終馴化和研究任何微生物都是可能的。1.Lagier, J.-C. et al. Nature Rev. Microbiol. 16, 540–550 (2018).2.Ngom, I. I. et al. New Microbes New Infect. 33, 100624 (2020).3.Yimagou, E. K. et al. New Microbes New Infect. 32, 100606 (2019).4.Berdy, B., Spoering, A. L., Ling, L. L. & Epstein, S. S. Nature Protoc. 12, 2232–2242 (2017).5.Rheims, H., Rainey, F. A. & Stackebrandt, E. J. Indust. Microbiol. 17, 159–169 (1996).6.He, X. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 244–249 (2015).7.Cross, K. L. et al. Nature Biotechnol. 37, 1314–1321 (2019).8.Gich, F., Janys, M. A., König, M. & Overmann, J. Environ. Microbiol. 14, 2984–2997 (2012).9.Imachi, H. et al. Nature 577, 519–525 (2020).10.Tanaka, T. et al. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7659–7666 (2014).原文連結：https://www.nature.com/articles/d41586-020-01684-z猜你喜歡
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