來源：來源網絡 2006-12-17 23:12
蛋白產物的檢測
一、組織蛋白的裂解提取：
1.分別取-70℃保存的各組動物的樣品（半個腦、0.5g肌肉），放入小離心管中，在冰浴上以PBS充分洗滌2次，除去殘留血液。
2.用無菌手術剪和鑷子將大鼠肌肉剪碎（腦樣品不用剪碎），放入另一小離心管中，於0℃以PBS充分洗滌，4℃，3000 rpm離心5分鐘。
3.吸出上清夜，儘量將管壁上的液滴吸淨，將組織碎片轉移至組織勻漿管內。
4.取2ml的裂解緩衝液（預冷至0℃），加入20μlAprotonin,20μl Trypsin，20μl NaoN4,20μl的PMSFb,20μl的leupeptins和2μl的DTT，混勻後加入勻漿管內，在組織勻漿器上冰水浴勻漿，注意轉速不超過50000 rpm。4℃放置2h，10000 rpm 4℃ 離心10分鐘(可延長)，吸取上清液（蛋白液）-20℃保存。
二、蛋白的含量測定—染料結合法
（一）基本原理：考馬斯亮藍G-250(CBBG-250)具有紅色和青色兩種色調，在游離狀態下呈紅色型，一旦與蛋白質結合就變為青色，色素的最大吸收波長從465nm移到595nm，測定595nm處光密度值的增加即可進行定量。
（二）標準曲線的繪製：
分別在5個1.5ml appendoff管中各加入1μg/μl的BSA 0、1.25、2.5、5、10μl，以0.15mmol的NaCl補足至100μl，每管各加入考馬斯亮藍染料溶液1ml，室溫放置2min。用1cm光徑的微量比色杯測量，取A595吸光度值對標準蛋白濃度作圖，畫出標準曲線。
（三）樣品中蛋白含量的測定：
將裂解液作二十倍稀釋後，按照標準曲線測定待測樣品的A595，從BSA標準曲線中確定待測樣品的濃度。
三、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳
（一）在蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳中，SDS和蛋白以1.4:1的比例結合形成複合物，確保蛋白質的解離狀態，並儘量減少多肽亞基間的聚合。這種凝膠電泳的特點是可以對樣品進行濃縮，並具有分子篩效應，因而大大提高了樣品的解析度。
（二）試劑：
1. 30%丙烯醯胺溶液：29%（w/v）丙烯醯胺1%（w/v）N,N-亞甲雙丙烯醯胺,溶於去離子水，室溫下棕色瓶中避光保存。
2. 1.5mol/l Tris• Cl( PH 8.8):取91g的Tris base加水至近500ml，用濃HCl調節PH至8.8，室溫保存。
3. 1.0 mol/l Tris• Cl( PH 6.8):取30.5g Tris base 加水至近250ml，用濃HCl調節PH至6.8，室溫保存。
4. 10% 過硫酸銨:去離子水配製，配10ml，4℃保存，一周內使用。
5. 加樣緩衝液：2%SDS 50mMOL/L Tris•Cl（PH6.8） 10%甘油 50mMOL/L DTT 0.1%溴酚藍
6. 電泳緩衝液：25mmol/ltris.cl( PH 8.0) 25mmol/l甘氨酸 0.1% SDS( PH 8.3)
(三)操作步驟：
1.配製分離膠（8%，10ml）：
去離子水4.6ml ; 30%丙烯醯胺溶液2.7 ml ; 1.5M Tris（PH 8.8）2.5 ml ; 10% SDS 0.1 ml ; 10%過硫酸銨0.1 ml ; TEMED（N，N，N』，N』-四甲基乙二胺）0.006 ml
2.加入TEMED以後，迅速混合併灌注在膠板內，注意留出灌注成層膠所需空間（梳子的齒長再加1㎝）。用水封膠。室溫下（約20分鐘）聚合。
3.聚合後棄去水封，用濾紙吸乾。
4..配製積層膠：
去離子水2.7ml ; 30%丙烯醯胺溶液0.67 ml; 1.5M Tris（PH 6.8）0.5ml; 10% SDS0.04ml; 10%過硫酸銨0.04ml ;TEMED（N，N，N』，N』-四甲基乙二胺）0.004 ml
5.先插入梳子，然後加入TEMED混勻後立即在聚合的分離膠上灌注積層膠，小心避免混入氣泡，凝膠垂直放置於室溫下（積層膠聚合的同時，把樣品和加樣緩衝液混合，100℃加熱3min使蛋白質變性）。
6.成層膠聚合完全後 (20分鐘)，小心移出梳子，把凝膠板轉移至電泳裝置上,準備上樣。
7.上樣：小心將微量加樣器插入樣品孔上方，輕輕推入樣品40μl，防止注射器內氣泡進入孔內（Maker加20μl）。
8.電泳：將垂直電泳槽中加入電泳緩衝液（液面中間高於兩邊）。接上電源開始電泳。開始電壓50V，當染料進入分離膠後（約0.5h），電壓增加到100V，繼續電泳至溴酚藍到達分離膠底部後切斷電源（約2h）。
9.取膠：用刮勺撬開玻璃板，取下凝膠用於Western blot分析。
四、Western blot分析
（一）基本原理：Western blot是針對蛋白質產物的一種較靈敏的檢測方法。它把凝膠電泳分離後的多肽從凝膠轉移到固相支持物，並用針對特定胺基酸的抗體做為探針進行檢測，可檢測出1ng~5ng的蛋白。
（二）試劑：
1.轉移緩衝液：39mmol/l甘氨酸；48mmol/lTris.Cl；0.037%SDS。
2.封閉液：5%脫脂奶粉；0.01%防沫劑A；0.02%疊氮鈉；溶於PBS中。
3.麗春紅S染液：0.1g麗春紅S；0.1ml乙酸，加水至100ml。
4.封閉液：5%（W/V）脫脂幹奶粉；25mM Tris （PH 8.0）；12.5mM NaCl；0.05% Tween-20，配成1000ml
5.顯色液：6mgDAB+9mlPBS+1ml0.3%CoCl+30%H2O210μl
（三）操作方法：
1.戴手套切取八張與凝膠大小一致的濾紙和一張硝酸纖維素濾膜於轉移緩衝液中。
2.戴手套安裝電轉移裝置，在電極上平放兩張浸過轉移緩衝液的濾紙，然後把凝膠放在濾紙上，再把硝酸纖維素膜放上，最後放上兩張濾紙（要準確對齊，各層間無氣泡）。
3.安裝轉移裝置，加入轉膜緩衝液（膜正膠負）接通電源，電壓30V，12-16h（通常過夜）。轉移結束後，取出硝酸纖維素膜，切去一角作標記。注意：為避免短路，不要切去凝膠一角做標記。
4.轉移後的硝酸纖維素濾膜用麗春紅S染色、洗膜以確定轉膜是否成功
5.洗膜：電泳帶出現後，先用去離子水漂洗，再用PBS在雜交箱洗3次（37℃，10min）。
6.濾膜的封閉：將濾膜放入帶蓋的塑料平皿中，加入封閉液，蓋上平皿蓋，室溫平搖1～2h（可省去）。
7.與一抗反應：將一抗用封閉液稀釋成1：500，加入裝有硝酸纖維膜的平皿中，37℃輕搖2h。
8.濾膜的清洗：濾膜用PBS漂洗3次（37℃，10min）。
9.與二抗（酶聯二抗）的反應：將二抗用封閉液稀釋成1：500，加入裝有硝酸纖維膜的平皿中，37℃搖動1~2h。
10.DAB顯色：
11.用數字顯像儀對濾膜進行圖象拍照和分析。
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