撰文 | 鹹姐
PIWI相互作用RNA即piRNA，是2006年被發現的一類動物特有的小非編碼RNA，長度約為24-31個鹼基。不同於microRNA和siRNA，piRNA可以引導與之相互作用的PIWI蛋白靶向降解目的轉錄本，促進異染色質組裝和DNA甲基化。此外，piRNA通路的結構使其既能對快速進化的病毒和轉座子提供適應性的、基於序列的免疫，又能對保守的宿主基因提供免疫。在大多數動物的生殖細胞中，piRNA能使轉座子沉默，而體細胞piRNA的功能則在進化過程中不斷丟失、獲得、再丟失【1】。
在生殖細胞中，piRNA的生物合成伴隨著來自轉座子和piRNA簇的互補轉錄本的相互切割，這個過程被稱為「桌球循環」（ping-pong cycle）【2】。桌球循環產生成對的piRNA（「啟動」和「應答」piRNA），它們在5』-端有10個鹼基的重疊，並在「應答」piRNA的下遊有多個「尾隨」piRNA產生。具體來說，「桌球循環」由一個結合了PIWI蛋白的「啟動」piRNA對前體轉錄物進行剪切所啟動的，PIWI裂解得到的5』-單磷酸基片段被作為piRNA前前體（pre-pre-piRNA）傳遞給相應的PIWI蛋白，隨後被裂解。由此產生的5』裂解片段被稱為piRNA前體（pre-piRNA），其3』-末端可被3』,5』-核酸外切酶Trimmer進一步修飾剪切為成熟長度，同時被甲基轉移酶Hen1催化發生2』-O-甲基化，從而成為「應答」piRNA。
Hen1介導的2』-O甲基化作用可以保護成熟的piRNA不被降解，並加強其與PIWI蛋白的結合。與此同時，pre-pre-piRNA的3』端裂解片段作為新的pre-pre-piRNA與下一個PIWI蛋白結合，並再次被裂解，產生一個新的結合了PIWI的pre-piRNA，然後，經過Trimmer和Hen1在3』-端的加工成為成熟的「尾隨」piRNA，而這次得到的3』切割片段也被引入到下一個PIWI蛋白中，作為新的pre-pre-piRNA，自此，在「應答」piRNA下遊連續產生了一系列「尾隨」piRNA。piRNA生物生成的這兩條途徑就導致了piRNA的依賴於靶序列的擴增（通過「桌球循環」）和piRNA序列的擴增（通過「尾隨」piRNA的產生）【1,3】（圖1）。
圖1 動物生殖細胞中piRNA生物合成模型
雖然，目前對於piRNA生物合成的機制大致可以歸納為上述模型，但是，這個模型中仍有很多不明了的地方，其中之一就是pre-piRNA的具體產生機制。目前，人們認為核內切酶Zucchini（小鼠中稱為MitoPLD或PLD6），作為線粒體外膜蛋白，是催化pre-pre-piRNA裂解為pre-piRNA的主要酶，但是卻缺乏直接證據，並且其切割方式也一直存在著模稜兩可甚至矛盾的地方，一方面，因為「尾隨」piRNA通常以一個5』-端的尿嘧啶鹼基（U）開始，人們認為在體內Zucchini的裂解優先發生在鹼基U前面（+1U偏好）；但是另一方面，純化的Zucchini在體外又表現出非特異性的核糖核酸內切酶活性。
因此，為了更準確地分析pre-piRNA的產生機制，近日，來自日本東京大學的Yukihide Tomari研究團隊在Nature上發表題為Zucchini consensus motifs determine the mechanism of pre-piRNA production的文章，建立了Trimmer敲除桑蠶細胞系，並利用一個無細胞系統，首次詳細準確地揭示了pre-piRNA產生的兩條平行機制——依賴於Zucchini和不依賴於Zucchini，強調了多路復用系統對強大而靈活的piRNA生物合成的重要作用。
為了準確地研究pre-piRNA是如何從pre-pre-piRNA生成的，就必須阻止Trimmer 對pre-piRNA的進一步加工。因此，本文的研究人員首先在桑蠶細胞系BmN4中用CRISPR-Cas9敲除Trimmer，產生Tri-KO細胞系。經小RNA測序分析顯示，與野生型細胞中大量的成熟piRNA所產生的單一峰不同，Tri-KO細胞系中的小RNA長度呈現明顯的雙峰分布，作者將長度小於30nt的峰所代表的pre-piRNA稱為N型，而大於30nt的那一類稱為E型。在研究人員敲低了Tri-KO細胞中的Zucchini（BmZuc）的表達後，他們發現，BmZuc介導了E型pre-piRNA的生成，並且這種介導不依賴於pre-pre-piRNA所結合的PIWI蛋白的類型；而N型pre-piRNA則是通過與BmZuc無關的、由下遊互補piRNA引導的剪切所生成的。同時，研究人員還發現，與N型pre-piRNA相比，由BmZuc介導產生的E型pre-piRNA發生2』-O-甲基化的作用效率更高，其分子更穩定。
隨後，研究人員建立了一個無細胞體系，在體外模擬再現了BmZuc介導的E型pre-piRNA的產生，其需要RNA解旋酶Armitage的參與，並依賴於ATP，而且BmZuc的酶切作用表現出U鹼基偏好。在這個系統中，研究人員發現，BmZuc並不總是立刻在U鹼基前切割，而且天然的E型pre-piRNA也僅表現出適度的+1U偏倚。因此，本文的研究人員認為，之前所提出的U鹼基偏好並不能完全解釋BmZuc的切割機制。為了全面、無偏倚地研究BmZuc的底物特異性，研究人員在Tri-KO細胞中進行了質粒文庫篩選，重點研究了出現頻率最高的6個鹼基後，確定了一段對BmZuc精確切割非常重要的共同基序（10A, 2A, 1U, 0U, +1U, +4C），該基序的全部突變將導致BmZuc不切割，從而影響pre-piRNA的產生。因此表明，pre-pre-piRNAs的序列對桑蠶pre-piRNAs的產生起著重要的作用。進一步地實驗表明，PIWI蛋白的種類可以影響BmZuc的這種底物特異性以及下遊「尾隨」piRNA的產生。換句話說，雖然+1U與 「尾隨」piRNA的產生緊密相連，但它本身並不是BmZuc介導的切割的先決條件，在果蠅Piwi結合的piRNA和小鼠MILI-和MIWI結合的粗線期 pre-piRNA中觀察到的強+1U偏倚可能反映了這些PIWI蛋白影響下，「尾隨」piRNAs的高效產生。
綜上所述，本文證明了桑蠶的pre-piRNA是由兩個平行的內切酶機制產生的——Zucchini介導的切割和PIWI催化的切割（圖2），這種多路復用系統支持了只有兩種PIWI蛋白的桑蠶的強大而靈活的piRNA生物合成過程。與此同時，證明單一的+1U偏好不足以確定Zucchini的切割位點，首次揭示了Zucchini的切割發生在pre-pre-piRNA上的之前未被認識的一段共有基序上，並且這個過程需要RNA解旋酶的參與，且伴隨著pre-piRNA的2』-O-甲基化，為piRNA生物合成模型增添了濃墨重彩的一筆。
圖2 桑蠶pre-piRNA的產生和3』-端成熟模型
https://doi.org/10.1038/s41586-020-1966-9
製版人：Kira
參考文獻
1. Ozata, D. M., Gainetdinov, I., Zoch, A., O』Carroll, D. & Zamore, P. D. PIWI-interacting RNAs: small RNAs with big functions.Nat. Rev. Genet.20, 89–108 (2019).
2. Brennecke, J. et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila.Cell128, 1089–1103 (2007).
3. Gainetdinov, I., Colpan, C., Arif, A., Cecchini, K. & Zamore, P. D. Single mechanism of biogenesis, initiated and directed by PIWI proteins, explains piRNA production in most animals.Mol. Cell71, 775–790 (2018).
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