CD19 CAR-T細胞治療急性淋巴細胞白血病後復發機制的研究進展
2017-03-30
急性淋巴細胞白血病（ALL）是兒童最常見的惡性腫瘤，近年隨著診斷分型技術的提高及聯合化療的應用，長期生存率已達90%，但復發難治性B系急性淋巴細胞白血病（B-ALL）仍是兒童白血病相關死亡率的重要原因。成人ALL的發病率低但預後差，5年總體生存率不到40%，復發患者預後的平均存活時間只有6個月。以嵌合抗原受體（CAR）修飾的T細胞為代表的腫瘤靶向免疫治療在體外和臨床試驗中表現出良好的靶向性、殺傷性和持久性，展示了巨大的應用潛力和發展前景，其中以靶向CD19分子的CAR-T細胞（CD19 CAR-T）在治療復發難治性B-ALL上取得的巨大成功則是目前此領域的一座裡程碑。在取得諸多成果後，其存在的問題也逐漸浮出水面。近年來關於治療後復發的報導層出不窮，更有治療後CD19轉陰的病例出現。本文就這一新興免疫療法的復發機制進行探討。
一、CAR簡介
CAR技術的基本原理是通過基因工程技術將識別某抗原分子的抗體可變區基因序列與淋巴細胞免疫受體的胞內區序列拼接後，通過逆轉錄病毒等載體轉染到淋巴細胞內，並表達融合蛋白於細胞表面，通過非主要組織相容性抗原複合物（MHC）限制性的方式識別特定抗原殺傷腫瘤細胞。為了增加CAR在患者體內的持續性及擴散性以提高其抗腫瘤作用，CAR的結構不斷被優化，根據增加的共刺激信號元件，如CD28、DAP10、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）等，CAR已從第一代優化到第三代，最新的第四代CAR又稱通用細胞因子殺傷重定向T細胞（TRUCKs）。目前應用於臨床大多數是第二代CAR，其體內持續性及擴散性明顯優於第一代。雖然第三代CAR也已應用於臨床，但目前尚無數據表明第三代CAR的抗腫瘤作用優於第二代。
二、CD19 CAR-T在難治復發性B-ALL中治療進展
CD19作為B細胞腫瘤的標誌性靶點，最早出現於晚期祖B細胞和早期前B細胞，在B細胞成熟並最終分化為漿細胞的整個過程都表達，但不表達於造血幹細胞及其他組織細胞。將識別CD19的抗體可變區基因序列與淋巴細胞免疫受體的胞內區序列拼接後，轉染至患者T細胞中，形成的CD19 CAR-T細胞能夠特異性攻擊具有CD19抗原的B細胞，從而促使機體清除具有CD19抗原的腫瘤細胞。
目前國內外多個研究機構都在進行CD19 CAR-T細胞治療的臨床實驗，其中復發或難治性B-ALL的治療緩解率約67%~90%。不同研究中CD19 CAR-T治療患者緩解維持時間也不一，短則維持2個月，長則3年疾病未見復發。但因各研究中患者的選擇及治療前的預處理、CD19 CAR-T的製備、CAR的結構、CAR-T的應用劑量以及臨床毒副作用的管理等因素都不盡相同，故很難在不同研究之間進行比較。然而，諸多臨床試驗均已經證實CD19 CAR-T細胞治療的安全性及有效性，但是CD19 CAR-T細胞治療後復發仍是CD19 CAR-T細胞臨床治療中一大挑戰。
三、CD19 CAR-T治療後復發機制
美國國家癌症研究所（NCI）在用CD19 CAR-T細胞治療20例復發難治性ALL雖取得顯著成果，完全緩解（CR）率達70%，但仍有2例患者分別在3個月和5個月之後復發，並且CD19轉為陰性。Maude等報導30例兒童及成人ALL採用CD19 CAR-T治療後，27例患者獲得CR，其中7例在CD19 CAR-T治療後6周至8.5個月期間復發：4例CD19陽性，3例CD19陰性。Grupp等報導2例ALL患者在經過CD19 CAR-T輸注治療後均在1個月內獲得CR。其中1例患兒持續緩解，另1例患兒2個月後復發，且復發後腫瘤細胞CD19為陰性。在2013美國血液學會（ASH）年會上，費城兒童醫院（CHOP）報導17例患者CD19 CAR-T治療後，14例（82%）在1個月內實現CR，其中CR患者中有3個復發：2例CD19陽性，1例CD19陰性。
目前研究表明，CD19 CAR-T細胞治療復發難治性B-ALL後復發存在兩種模式：（1）流式細胞技術仍可檢測到B系標誌物CD19，即CD19陽性白血病復發；（2）流式細胞技術不能檢測到B系標誌物CD19，即CD19陰性白血病復發。復發的原因可能包括CAR-T細胞在部分患者體內的持續時間短，以及腫瘤抗原表達逃逸變異等。臨床研究發現患者外周血的CAR-T細胞減少或者消失，隨即出現白血病的復發，往往研究者為防止這部分患者復發，再次追加注射CD19 CAR-T，但維持白血病緩解的效果不一。這也間接說明CAR-T細胞只是暫時控制而沒有完全清除白細胞克隆，通過延長T細胞的持久性可以阻止一部分腫瘤復發。研究報導CD19 CAR-T治療前採用5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine）、依魯替尼（ibrutinib）、氟達拉濱（fludarabine）、環磷醯胺（cyclophosphamide）等化療藥物及雙特異性抗體（blinatumomab）預處理，可以增加CAR-T的體內持續性及其抗腫瘤效應[25，26]。由於所有臨床研究應用的CD19 CAR-T細胞均是採用鼠源的單鏈可變區（scFv），這也可能是患者體內CAR T細胞丟失的原因之一，通過將鼠源的scFv換成人源scFv減少CAR-T的免疫原性，從而可能增加CAR在體內的持續性。
然而，CD19陰性復發則不能通過延長T細胞的持久性阻止，而且CD19陰性復發對CD19 CAR-T細胞治療耐受。並且CD19陰性復發佔所有CD19 CAR-T治療後復發的10%~20%。因此，探討CD19陰性復發機制對CAR-T治療B-ALL具有非常重要意義。
Grupp等對1例CD19 CAR-T治療後CD19陰性復發的患兒標本進行細胞流式檢測，並與CAR-T治療前的細胞流式結果對比，結果表明CD19陰性腫瘤為原存在的小克隆，在CD19 CAR-T選擇性壓力下發展為主導克隆，導致CD19陰性白血病復發。Sotillo等通過對CD19 CAR-T治療後CD19陰性復發患者CD19基因進行全外顯子測序及RNA測序，揭示CD19基因的2號外顯子存在多種有意或無意突變，但並沒有導致CD19表達沉默，而在選擇性剪切的作用下表達缺失2號外顯子的截短蛋白，從而不能被CD19 CAR-T識別，並逃逸其殺傷作用耐受CD19 CAR-T治療。由此通過某種方式靶向幹預CD19截短蛋白的表達，可能為臨床避免CD19陰性復發提供新思路。
Gardner等運用CD19 CAR-T治療7例具有混合系白血病（MLL）基因重排的B-ALL患者，患者均獲得CR，然而其中2例患者1個月內以急性髓細胞白血病（ AML）復發，包括CD19在內的淋巴系抗原標記均轉陰。表明CD19 CAR-T治療選擇下AML克隆耐受CD19 CAR-T治療，從而發展為優勢克隆導致復發。AML克隆可能CD19 CAR-T治療壓力下由原B-ALL腫瘤細胞去分化或非定向前體細胞分化而來，或是原本存在的AML小克隆在CD19 CAR-T的壓力性選擇下發生克隆膨脹。此報導提示臨床CD19 CAR-T治療MLL-B-ALL，患者容易轉化為AML導致復發，CAR-T治療後CR應儘快採取移植。
Jacoby等通過對小鼠B-ALL腫瘤模型研究表示，CD19 CAR-T作用壓力下，可誘導B-ALL腫瘤細胞發生部分或完全的免疫表型改變，引起CD19表達降低或者沉默，從而耐受CD19 CAR-T治療，並且此過程涉及多種基因表達改變，例如與B細胞相關的重要轉錄因子Pax5及Ebf1等。
根據以上文獻總結CD19 CAR-T治療B-ALL後CD19陰性復發機制是發生了克隆取代，即CD19陽性克隆被CAR-T清除，CD19陰性克隆發展為主克隆，而CD19陰性克隆的CD19蛋白可能表達沉默或者表達異常，但目前尚不明確CD19陰性克隆出現的機制是原本就存在的小克隆，還是化療或CD19 CAR-T作用下原腫瘤細胞發生重塑，或者以上機制同時存在。
為了防止CD19 CAR-T治療後CD19陰性復發，雙特異性抗原靶點的CAR-T也許是一個治療選擇。同時採用2個B細胞特異性抗原的CAR，或者一個CAR具有2個特異性的靶點，如CD19/CD20雙特異性的CAR，抑或採用2群不同的T細胞分別製備表達不同特異性的CAR 。CD22 CAR-T可以作為一個替代靶向目標，但還需要更多的臨床試驗進一步探索。
基於諸多臨床試驗總結，研究者認為目前CD19 CAR-T治療可能不能單獨徹底治癒白血病，但CD19 CAR-T可為造血幹細胞移植提供一個寶貴的時間窗。復發B-ALL在二線化療中大約只有30%的緩解率，而對於難治復發性成人患者，只有5%的患者有機會進行移植，並且伴有微小殘留病的患者移植後的效果要遠遠差於分子學完全緩解患者的效果。因此，CAR-T可通過其強大清除腫瘤的能力使這些難治性患者獲得暫時的分子學緩解狀態，以創造一個可以進行移植的機會並改善這部分患者的臨床預後。對於CD19 CAR-T之後不採取移植的患者，CD19 CAR-T則可能需要體內更長的持續性以防止可能出現復發及免疫逃逸等情況。
四、前景方向
CD19 CAR-T細胞在ALL等血液系統惡性腫瘤早期臨床試驗顯示了不俗的業績，但治療後復發及抗原標記轉陰仍是今後需克服的難題，目前關於復發機制的研究並不多。根據目前所知復發轉陰機制增加相關臨床試驗的進行，減少CAR-T治療後復發的概率以增加病患的生存率將成為CAR-T發展的新方向之一。另外其對於實體腫瘤只有非常有限的臨床經驗，因而研究者必須開發創新的理念來尋找合適的靶目標，克服腫瘤介導的免疫抑制。總之，CAR-T細胞免疫治療在臨床中的應用和推廣非常值得期待，在將來是否能作為一種免疫藥物成為標準醫療治療的一部分還需要進一步的努力和探索。
來源：中華醫學雜誌2017,97(08):629-631
註：
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