淋巴系統惡性腫瘤包括淋巴細胞白血病、淋巴瘤，是發生在B細胞、T細胞及NK 細胞等淋巴細胞上的腫瘤。目前其治療存在許多困難，特別是臨床上常常遇到的疾病復發和難治，而治療的失敗與此有關。近10多年來，淋巴系統腫瘤的臨床治療取得了很大進展，抗CD20單抗廣泛應用於CD20陽性的B細胞非霍奇金淋巴瘤，取得良好的療效，已經成為臨床一線用藥。但是，由於淋巴瘤和急慢性淋巴細胞白血病的細胞表面往往僅有CD19抗原，美羅華一類的抗CD20抗體對其無明顯治療作用，因此迫切需要一種新的治療方法來提高淋巴瘤和急慢性淋巴細胞白血病的治癒率。
嵌合抗原受體T細胞免疫療法（CART）細胞，是一種嵌合抗原受體的T細胞，通過基因修飾使T淋巴細胞表達特定的CAR，該細胞可以特異性識別靶抗原，殺傷靶細胞。CART細胞具備針對特定腫瘤抗原的高度親和特性，從而能高效殺傷表達該抗原的腫瘤細胞。CD19在不同分化階段的B淋巴細胞表面均有特異性表達，95%以上的B細胞淋巴瘤和B淋巴細胞白血病均表達CD19抗原。建立識別CD19嵌合抗原受體的CART細胞，可以實現對B淋巴細胞腫瘤的治療目的。本文將主要論述CD19-CART細胞抗淋巴細胞腫瘤的機制、CD19-CART細胞在B淋巴系統疾病中的臨床應用以及CD19-CART細胞治療的不良反應和風險。
一、CD19-CART細胞抗淋巴細胞腫瘤機制
細胞毒T細胞是經抗原遞呈細胞（APC）激活的CD8+T淋巴細胞。研究表明T 細胞的活化依賴雙信號途徑活化增殖為細胞毒T細胞：其中第一信號途徑為APC上的MHC分子-抗原肽複合體和存在T細胞上的T細胞受體結合，第二信號途徑為APC表面的B7共刺激分子與T 細胞表面的CD28分子結合。當細胞毒T 細胞與攜帶相同MHC分子-抗原肽複合體的腫瘤細胞相遇時與之結合，釋放穿孔素，可以導致細胞溶解。此外，還能分泌顆粒酶，誘發靶細胞的凋亡。
CART設計的關鍵是選擇適當的腫瘤抗原作為靶標，由於B淋巴細胞的各個分化階段多表達CD19，而其他非B細胞沒有CD19的表達，因此針對CD19的CAR是目前臨床上研究最多的CART細胞，在惡性B淋巴細胞腫瘤如B細胞急性淋巴細胞白血病（ALL）、慢性淋巴細胞白血病（CLL）及非霍奇金淋巴瘤治療中被廣泛臨床試驗。此外，動物實驗已證實，針對CD19的CART細胞能對表達CD19+ 的B淋巴細胞腫瘤產生有效的攻擊。在存在免疫缺陷的小鼠體內，輸入CD19+ 靶向T細胞後，發現CD19+ 腫瘤細胞被有效清除。
二、CD19-CART細胞的臨床應用
1. CD19-CART細胞在B細胞淋巴瘤中的應用
CD19-CART細胞的研究是目前對於B細胞淋巴瘤的熱點。2010年Kochenderfer等首先報導了CD19-CART細胞在治療復發難治濾泡淋巴瘤的作用。2012年Kochenderfer等報導了8例復發難治B細胞淋巴瘤患者均接受CART 細胞治療，包括4例CLL，3例濾泡淋瘤及1例脾邊緣區B細胞淋巴瘤。結果顯示8例患者中1例達完全緩解（CR），5例達部分緩解（PR），1例疾病穩定；對患者的細胞因子IFN-γ和TNF水平檢測，發現其中4例明顯升高。2013年Kochenderfer報導了14例復發難治患者，其中8例為原發縱隔的大細胞淋巴瘤（PMBCL）或瀰漫大B 細胞淋巴瘤（DLBCL），4例CLL，1例惰性NHL，1例邊緣區B細胞淋巴瘤（SMZL）；8例PMBCL或DLBCL中5例治療後達CR或PR。2014年Rosenberg團隊再次增加了他們的研究樣本，15例難治復發B淋巴細胞腫瘤患者接受CART治療，其中9例為DLBCL，4例為CLL，2例為惰性淋巴瘤，結果8例達CR，4例達PR，1例淋巴瘤穩定。
美國國立癌症中心在CD19-CART治療中也取得了許多成果，他們利用反轉錄病毒轉染的19-28ZCART治療B淋巴細胞腫瘤。27例患者中22例有效，獲得CR或PR，其中1例患者CR持續37個月。在2014年第56屆ASH 會議上該中心報告了最新進展：CART治療9例難治性DLBCL，並聯合減低劑量化療，結果1例達CR，4例達PR，2例預後差。
2. CD19-CART細胞在B細胞淋巴細胞白血病中的應用
CD19-CART細胞能夠識別B淋巴細胞白血病的特異性CD19靶點，通過釋放穿孔素及顆粒酶等細胞因子，對表達CD19抗原的B淋巴細胞進行攻擊，從而促使機體清除惡性淋巴細胞。美國斯隆-凱特琳癌症中心在治療難治復發的B-ALL應用了自體19-28zCART技術，16例患者中14例獲CR，甚至對移植後復發的Ph+ALL也有效。通過CART治療也為異基因造血幹細胞移植創造了條件。賓州大學也報告了應用19-CD137zCART治療B細胞腫瘤結果，30例難治復發的B-ALL，27例達CR，6個月無病生存率達67%，總生存率78%。
Brenyjens等應用第2代CART細胞，即轉染了CD28/CD3-ζ的CD19特異性CART 細胞，治療5 例復發B-ALL 患者。用PCR 測序檢測CART細胞數量和功能，結果顯示CART細胞在體內可迅速產生抗腫瘤作用，微小殘留病檢測很快轉陰，均達CR。Grupp等報導，應用第2 代CART細胞治療的2例難治性和復發性B-ALL患兒均獲CR，其中1例為臍帶血異基因造血幹細胞移植後復發，且對CD3、CD19雙特異性單克隆抗體blinatumomab耐藥。採用慢病毒載體轉染技術產生的包含4-1BB的二代CART細胞，輸注T細胞數為（1.4×106～1.2×107）/kg，細胞增殖1000倍以上，輸注後2周外周血淋巴細胞和中性粒細胞均明顯升高，淋巴細胞主要為T細胞，尤其是CART細胞。CART細胞在腦脊液中也可高水平存在至少6個月，而2例患者並無中樞神經系統白血病，預示CART細胞對中樞神經系統白血病的預防和治療作用。不良反應上，主要有粒細胞缺乏、發熱、低血壓、急性血管滲漏症候群、急性呼吸窘迫症候群、ALT 和AST升高等，無急性毒性反應。
2015年第56屆ASH會議，諾華在會上公布了業界期待的CART免疫療法CTL019的最新臨床數據，39 例復發難治ALL 患兒接受CD19-CART細胞治療，92%（36/39）達CR，隨訪6個月，69%（27/39）處於持續緩解狀態，總生存率達74%（29/39）。在用CD19-CART細胞治療24例CLL的研究中，50%（12/24）達CR；隨訪9個月，總生存率達67%（16/24）。
2013年ASH會議上，美國賓夕法亞大學公布了他們的最新臨床研究成果〔10〕。14例復發難治CLL患者接受CART細胞治療，輸注CART細胞中位數為1.4×108（0.14×108～5.90×108）。截至時間為2013年7月15日，據統計全部患者的中位隨訪時間為9.4（4～35）個月，有效患者為16（5～35）個月。結果發現14例患者中8例治療有效，其中3例達CR，對患者分別隨訪11、34和35個月，均未復發；5例患者達PR，其中2例在輸注4個月後出現復發。
2013年ASH 會議上報導了賓夕法尼亞大學的一項Ⅱ期研究成果，目的為了發掘發揮抗腫瘤效果的CART細胞最佳數量。該研究入組10例復發難治CLL患者，所有患者給予CART細胞治療，其中6例接受低數量（5×107）治療，4例接受高數量（5×108）治療，中位隨訪3個月，2組患者的有效率和不良反應均差異無統計學意義。
三、CD19-CART細胞治療具體實施方案
1. 患者T細胞的獲得
採集患者外周靜脈血100～200ml，100ml約含有（2～3）×108 個單個核細胞，經過體外分離、純化T細胞。
2. 體外製備特殊的CART細胞
慢病毒轉導分離純化的T細胞；經過培養增加效應細胞數量；嚴格質控、嚴格無菌操作，保證製備的CART細胞可以應用於臨床治療。
3. 治療方案
患者篩選和治療時機選擇
選擇的患者為CD19+ 復發難治的B細胞淋巴瘤或白血病患者，沒有自體或異體幹細胞移植適應證，或接受目前治療方案後預後較差（幾個月到2年的存活）；預計生存＞12周；ECGO評分0～2，或KPS評分＞60；肌酐＜2.5mg/dl；AST/ALT＜3×正常上限；膽紅素＜2mg/dl；自體幹細胞移植復發後患者不符合其他優先治療方案；可以進行靜脈採血，並且無相關禁忌；自願籤署知情同意書。
治療前化療
患者細胞治療前接受適當的化療，減少體內腫瘤細胞數量，減輕CART細胞治療後發生細胞因子釋放症候群（CRS）的概率和嚴重程度。化療將開始於CD19-CART細胞回輸前5～10天，進而保證在回輸前的1～2天完成化療。
因此，化療的起始時間取決於化療的跨度。化療的目的是誘導淋巴細胞缺失，促進移植和保持CD19-CART細胞的穩定擴增。化療的選擇也會降低腫瘤負荷。淋巴細胞清除方案不是本試驗方案的一部分，可以根據腫瘤專家選擇給藥。化療的選擇依賴於患者的基礎疾病和既往治療。氟達拉濱30mg/（m2·d）×3d和環磷醯胺300mg/（m2·d）×3d是可以選擇的化療藥，由於許多經驗表明這些藥物的使用能夠促進過繼細胞免疫治療。其他FDA 批准藥物的化療方案同樣合適，包CHOP，HYPerCVAD，EPOCH，DHAP，ICE等。
CART細胞回輸
採用劑量分次輸注，從小（1×108）到大的方式，將製備好的CART細胞回輸給患者。首次劑量採用d0，1，2爬坡劑量，d0給藥10%的細胞，d1給藥30%的細胞，d2給藥60%的細胞。如果患者有足夠的CD19-CART 細胞可用，且患者對第1次回輸劑量能夠耐受，第2次CD19-CART細胞將於第11天向患者給藥（劑量108～109CART細胞，或109～1010 T細胞）。
輸注後治療嚴密監控患者是否有臨床併發症
CD19-CART細胞回輸後不良反應包括短暫發熱、畏寒、噁心和寒顫。對大量腫瘤細胞破壞產生的CRS等情況給予相應的預防及處理。推薦受試者在CD19-CART細胞回輸前，預先口服對乙醯氨基酚650mg，以及口服或靜脈注射25～50mg鹽酸苯海拉明。如果乙醯氨基酚不能緩解持續發燒的患者，建議使用非類固醇消炎藥。通常不建議患者系統性使用皮質類固醇藥物，如氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍或地塞米松，除非在危及生命的緊急情況下才可使用，因為這些藥物對CART 細胞治療有不良影響。
4. 治療的後續跟蹤
患者在回輸CART細胞後第1個月，每周隨訪1次，受試者在2～6個月每月回醫院複查，回輸後的2年內受試者每季度回醫院複查，對疾病情況及療效、安全性進行評估。
四、CART細胞治療不良反應和潛在風險
1. CRS
CRS是CART 細胞治療常見的不良反應之一，CRS是高級別免疫激活所導致的一種非抗原特異性毒性，與包括IL-6和IFN-γ在內的細胞因子循環水平的升高相關。其發生機制為靜脈滴注CART後患者T、B淋巴細胞，NK/T 細胞和巨噬細胞等釋放大量的細胞因子、趨化因子，而這些炎症介質導致的炎性反應會引起組織損傷，導致微血管病變、心臟衰竭甚至死亡。臨床表現為噁心嘔吐、頭痛頭暈、心率增快、血壓下降、皮疹、胸悶氣促等。
CRS的最新管理指南將其分為5個級別，Ⅰ級無生命危險，一般以發熱為主，對症處理即可；Ⅱ級及以上級別均需不同的幹預及支持治療。降低CRS的方法包括適當改變細胞培養方法或者在輸注細胞後使用藥物來阻斷細胞因子的作用，使CART細胞在治療中所產生的細胞因子減少，免疫抑制劑託珠單抗（一種抗IL-6受體抗體）和激素可以扭轉該症候群。另外一種方法為將自殺基因導入CART 細胞，當出現CRS時可以啟動自殺基因，降低CRS發生。
2. 脫靶效應
由於CART細胞與腫瘤相關的抗原具有高度親和力，是針對腫瘤的相關抗原，但當其與正常組織表達的腫瘤相關抗原結合後，對正常組織產生毒性反應，稱之為脫靶效應。為了預防脫靶效應，可通過如下方法：降低每次CART細胞量；應用抗體封閉正常組織上的腫瘤相關抗原；引入自凋亡基因系統。低球蛋白血症是CD19-CART細胞治療的脫靶毒性之一，由於B淋巴細胞缺乏引起，可補充人免疫球蛋白。
3. 腫瘤溶解症候群
腫瘤溶解症候群的發生與T細胞在患者體內增殖過快、腫瘤細胞在治療後大量死亡以及大量細胞因子的釋放有關，可用鹼化、水化及藥物緩解。
4. 其他不良反應
在CD19-CART細胞治療的臨床試驗中，會碰到一些少見的不良反應。Brentjens等報導1例患者在接受細胞治療後24h，開始出現高熱、氣喘，後出現腎功能不全，CART細胞輸入44h後患者死亡。Kochenderfer等報導，1 例患者在輸入CART細胞18d後出現肺部感染，為流感病毒感染，最終患者死亡。
五、目前仍然存在的問題
可以肯定的是CD19-CART細胞治療技術應該是個體化的，但除了CAR本身的設計會對治療效果產生影響外，應用時機、患者的基本狀況、輸注的劑量等，都會對臨床效果產生重大的影響。不同的基因載體會影響到CART 細胞功能，目前正在使用的載體有γ反轉錄病毒、慢病毒、質粒等。即使CAR 結構相同，不同研究中心培養出來的CART細胞會有很大差別。新一代CAR的組成中加入了共刺激區，尤其是共刺激區CD28或CD137的加入使細胞在體內增殖及抗腫瘤活性明顯增強。
CART細胞輸注的數量變化範圍較大，一般在105～107/kg，最理想的是用最少的細胞數量獲得最佳療效，但這些還需要更多研究證實。如何提高療效是研究的方向。Xu等通過5個中心的臨床試驗分析，總結出了提高CART細胞療效的因素：預處理清除淋巴細胞；IL-2輸注；CART細胞持續時間≥4周；外周血CART細胞峰值≥0.1%；IFN-γ峰值≥200pg/ml；而輸注的T 細胞數量及CD4+/CD8+ 比值無明顯意義。因此基於這些因素，我們可以採取相應的改進從而提高療效，包括CART細胞的結構，從第1代到第4代的提升；輸注前預處理及細胞因子應用；基因轉導從逆轉錄病毒到慢病毒等。不良反應強度與效的關係也是目前需要研究的問題。症狀出現的時間點以及CRS嚴重度取決於誘導藥物、免疫細胞活化程度以及腫瘤負荷。大部分研究表明，回輸前化療清除體內淋巴細胞能增強抗腫瘤效應。Porter等應用CART細胞成功治療3例CLL患者，發現CART細胞輸入體內後，IFN-γ、CXCL9、IL-6以及可溶性IL-2受體等細胞因子明顯增加，在輸入後第23天達到高峰，骨髓中細胞因子的升高與白血病細胞的減少水平相一致。CART細胞數量與腫瘤溶解症候群出現時間以及細胞因子升高水平相一致，為減少不良反應需要慎重選擇靶向抗原，並通過劑量遞增研究來確定最有效和安全的劑量。
六、結語
應用CART細胞靶向特異性治療CD19陽性的B細胞淋巴瘤及白血病患者，已經在臨床上取得顯著療效，有望得到廣泛應用。雖然目前CART治療開展時間較短，尚缺乏大規模的樣本，很多不良反應和併發症還需在臨床試驗中逐漸發現與解決。但是在已有報導的治療B細胞淋巴瘤及白血病的臨床試驗中，CART表現了非常顯著的療效，尤其對於復發難治的患者，因此為更大規模、多中心的臨床研究提供了依據。
來源：臨床血液學雜誌2017, v.30;No.217(05) 735-738
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