獨家丨楊輝對付向東教授的回覆

編者按：近日，網絡流傳了一封加州大學聖地牙哥分校付向東教授實名舉報中科院上海神經所楊輝研究員的舉報信，引起了同行熱議。BioArt也在密切關注此事的發展，為此BioArt聯繫到當事人尋求回應。現將楊輝團隊的回應材料全文公布如下：

針對付向東教授提出的幾點質疑，我的回覆如下：

1. 付向東教授在神經所做的報告是採用小分子抑制劑的方法，而他們在Nature發表的論文採用的卻是shRNA和ASO的方法。連他自己在Nature文章中都沒有提及他在報告中採用的小分子抑制劑的方法。他又是如何在當時向我們透入大量的技術細節的？他報告中的方法最終證明是錯誤或不可行的，難道已經公開發表5年的位點就可以霸佔，不允許其他人用新的技術來嘗試嗎？這和大佬圈地有何區別呢？

2. 根據付教授發表的文章和公布的專利（2018年4月遞交，2019年10月公開），絲毫沒有提及用基因編輯方法治療帕金森病。而且他還宣稱在我們注射的紋狀體腦區通過在星形膠質細胞內敲低Ptbp1幾乎不可能形成多巴胺神經元。而我們恰恰是在紋狀體中高效誘導出多巴胺神經元產生，進而達到治療效果。在舉報信中，他通過混淆視聽，讓大家認為我完全抄襲他的結果。

3. 付教授提到，他還分享了Ptbp1應用到視網膜疾病治療的工作，首先我確實不知道他的分享，其次，最近我們通過BioRxiv檢索，也找到2020年4月8日在線刊登的這篇文章。他們從實驗方法到動物疾病模型沒有一處一樣，更重要的是他們的目的是將穆勒膠質細胞轉分化為視錐細胞（Cone），而不是我們文章中的目的神經元視神經節細胞。兩篇文章的連實驗目的都不一樣，何來剽竊？付向東教授專利中涵蓋的疾病和方法，並沒有涵蓋任何RGC細胞的轉分化。可見他是如何向我透露這些技術細節？最後我想指出的是，我們Cell文章主要關注點是視神經節細胞的轉分化（7個主圖中有5個與視神經節細胞的轉分化有關）。

4. 關於我造假的言論，純屬污衊。我2013年Cell文章已經有許多實驗室重複出我們的結果和方法，詳見下文。他為了抹黑我，連基本的科學事實都不顧，這不是一個正派的科學家做的事情。

一、關於本人2020年Cell文章抄襲和剽竊美國加利福尼亞大學聖地牙哥分校付向東教授文章、造假的爭論

1. 付向東教授在神經所報告中提到的Ptbp1靶點，已經於2013年發表。他報告中提到利用小分子抑制劑靶向Ptbp1進行體內轉分化的相關研究。但是我們認為小分子藥物既沒有強大的分子靶向特異性，又沒有足夠的細胞靶向特異性，因此我們也意識到我們擅長的基因編輯策略具有很多的優勢。RNA靶向基因編輯技術不僅可以實現細胞靶向特異性，而且在體內可以實現高效特異性編輯。難道已經公開發表5年的位點就不允許其他人用新的技術來嘗試嗎？而且在他公布的專利中並沒有涵蓋利用基因編輯技術來實現轉分化，可見他們團隊當時並不是十分了解基因編輯技術。

2. 付向東教授說向我透漏了許多實驗細節。我們希望他能提供任何支持他觀點的證據。事實上，付向東教授在神經所做的報告是採用小分子抑制劑的方法，而他們在Nature發表的論文採用的卻是shRNA和ASO的方法。連他自己在Nature文章中都沒有提及他在報告中採用的小分子抑制劑的方法。他們又是如何在當時向我們透入大量的技術細節的？他報告中的結果最終證明是錯誤或不可行的，難道能讓所有其他人都不能嘗試他已經2013年報導的靶點嗎？這和大佬圈地有何區別呢？其次，根據付教授發表的文章和在我們文章投稿後公布的專利（公布時間：2019年10月17日），他發現在我們注射的紋狀體腦區幾乎不可能形成多巴胺神經元。而我們恰恰是在紋狀體中高效誘導出多巴胺神經元產生，進而達到治療效果。

事情的來龍去脈

我們實驗室從2014年至今一直致力於基因編輯技術在各個領域的應用以及安全性評價。這項工作的主要完成人為我實驗室博士後周海波，他在獲得神經科學博士學位後來到我實驗室，在神經研究方面具有非常強的背景和訓練。我們15年開始優化並測試利用基因編輯技術進行體內星形膠質細胞向神經元轉分化，並於2018年一月份將此項工作發表在Nature Neuroscience上。由於我們這篇文章中使用的基因激活元件太大，很難實現體內運輸，導致很難應用此技術進行神經元轉分化通過成體治療的方式治療神經系統疾病。但我們一直都沒有就此停止探索其他利用基因編輯技術方式進行神經元轉分化的策略。2013年付向東教授在Cell上發表的文章證明，通過shRNA敲低Ptbp1基因就可以實現各種細胞向神經元的轉分化。雖然還有少數其他通過被抑制就可以實現神經元轉分化的靶點，但它們效率都很低，這點也在付向東教授的文章中進行了比較。因此， Ptbp1可以說是目前唯一個通過敲低就可以高效實現神經元轉分化的靶點，在領域內非常著名。

雖然考慮通過基因編輯抑制基因表達來實現神經元轉分化，但由於當時沒有合適的基因編輯工具出現，該想法就暫時被擱置。2018年3月15日，CasRx在Cell上發表，顯示極其高效的mRNA敲低效率，並且相對於shRNA技術具有更強的特異性。同時，CasRx體系足夠小，非常適合通過AAV遞送到體內進行靶向治療。這項技術與以往的shRNA相比展現了極大的治療潛力，我們認為小分子藥物既沒有強大的分子靶向特異性，又沒有足夠細胞的靶向特異性，因此我們敏感的察覺到我們擅長的基因編輯策略具有很多的優勢。所以我們迅速跟進。我們首先針對外源性的螢光蛋白進行了測試，並於2018年5月初得到了非常好的敲低結果。其後我們又針對一個內源性的治療靶點Vegfa進行了測試，因為該靶點是被驗證過的年齡相關性黃斑變性的治療靶點，而眼睛又是我們非常擅長遞送AAV且容易檢測的系統。2018年5月，我們首先在最擅長且最容易運輸的眼睛系統中檢測CasRx是否能在體內實現高效的mRNA敲低。2018年7月初我們獲得了非常好的CasRx體內敲低數據，之後我們全面鋪開在眼睛、耳朵、肝臟和大腦中對包括Ptbp1在內的已經明確發表的治療靶點進行大量測試。（2018年5月7號，我們首次在實驗室證明CasRx可以在細胞內靶向過表達的螢光蛋白mCherry，詳細數據請見附件一。隨後我們開始針對能夠通過敲低實現疾病治療的多個基因靶點進行了測試。）

2018年5月25日，我們拿到了通過CasRx在293T細胞內能夠高效的敲低黃斑病變的治療靶點VEGFA的數據。

2018年5月31日，我們拿到細胞內的數據，證明CasRx可以在對視網膜色素變性治療靶點Rho的點突變的RNA進行敲低。

2018年6月9日，在細胞內拿到CasRx能夠對遺傳性耳聾的治療靶點Tmc1敲低的數據。

2018年6月20日，在細胞內證明CasRx能夠對天使症候群的治療靶點Ube3a-ATS進行敲低。

2018年6月27日，在細胞內證明CasRx能夠對脊髓性肌萎縮症（SMA）的治療靶點SMN_AS1進行敲低。

2018年7月12日，在N2a細胞內證明CasRx能夠對帕金森症候群的治療靶點Ptbp1進行敲低。

2018年9月15日，在小鼠的N2A細胞內證明CasRx能夠靶向黃斑病變另外一個治療靶點Hif1a。

2018年11月3日，設計了CasRx靶向一型糖尿病的治療靶點HPD。

附文章審稿人意見

Reviewer comments: 「In particular, previous efforts of RNA-targeting CRISPR systems focused on knockdown of toxic mutant transcripts in models of mendelian inherited genetic disease, whereas this study presents the novel aspect of using these tools for in vivo therapeutic cell fate conversion, which is quite interesting and could be a broadly applicable approach.」

譯文：審稿人評論：「尤其是，以往的研究都集中在利用RNA靶向CRISPR系統來直接降低遺傳病模型中有害的突變轉錄本，而這項研究卻利用這些工具在體內進行治療性的細胞命運轉分化，從而展現一個全新的視角，這是非常有意思的，而且可以得到廣泛的應用。」

Reviewer comments: The concept of converting already present precursor cells to neurons that are capable of integrating and extending axons is extremely valuable。

「把已經存在的前體細胞直接轉化為擁有可以整合和延伸的軸突的神經元，這個概念極其的有價值。」

付向東教授於2018年6月14日來到神經所做報告。我們了解到，付向東教授在利用小分子抑制劑靶向Ptbp1進行體內轉分化的相關研究。我們一直認為小分子藥物既沒有強大的分子靶向特異性，又沒有足夠細胞的靶向特異性，因此我們仍一直堅持我們自己原有的基因編輯策略進行體內轉分化研究。後來我們從付向東教授後來的bioRvix中得知，他們用的方法是shRNA和ASO。關於抄襲的誣告，付教授聲稱把所有技術細節都告訴我了，希望他能提供任何支持他觀點的證據。根據付教授發表的文章和公布的專利（在我們投稿後公布），他發現在我們注射的紋狀體腦區幾乎不可能形成多巴胺神經元，而我們的結論與之恰恰相反，我們是在紋狀體中高效誘導出多巴胺神經元產生，進而達到治療效果。需要指出的是付向東教授的文章通過在GFAP-Cre轉基因小鼠結合Cre-dependent的shRNA實現帕金森症狀的治療，但是此項技術在臨床上是無法應用的。付向東教授還使用了ASO策略，但這種方法無法實現細胞靶向特異性。我們的文章，通過RNA靶向基因編輯技術不僅可以實現細胞靶向特異性，而且在帕金森小鼠模型上實現了非常好的治療效果。同時，我們的基因編輯方法可以在不同的非基因修飾疾病動物模型中進行應用，展示了強大的臨床潛力。關於穆勒膠質細胞標記的特異性低導致的誤標，我們的數據已經顯示可以實現非常特異的細胞靶向性。而且我們也非常樂意分享我們的方法以及材料，希望全世界所有感興趣的科學家進行重複。

關於在視網膜研究的指控

付教授提到，他還分享了Ptbp1應用到視網膜疾病治療的工作，我們通過BioRxiv檢索，也找到2020年4月8日在線刊登的，美國加州聖地牙哥大學的Kang Zhang與付向東教授合作的文章Visual function restoration in genetically blind mice via endogenous cellular reprogramming。

該文章中用到的方法、小鼠模型、質粒、病毒都與我們不同。而且，他們的研究是Rd10小鼠 (一種視錐細胞和視杆細胞退化的小鼠) 中進行的。最重要的是，他們的目的是將Muller細胞轉分化為視錐細胞（Cone），而不是視網膜神經節細胞。兩篇文章的連目的都不一樣，更沒有一樣的數據。

關於因GFAP-Cre可能會在RGC中表達洩露而懷疑我們作假，我認為，生物實驗最重要的是尊重實驗結果，而不是根據猜測或者 「眾所周知」而下結論。面對這個學術爭議，我立刻讓實驗室其他學生重複了這個實驗，實驗結果很好的驗證了我們結論的可靠性。這一實驗並不複雜，轉基因小鼠是常用的類型，國內外許多實驗室都可及；注射的病毒商業化的公司都可以提供，可現貨購買。小鼠和病毒準備好，只需要2-3周的時間就能驗證我們的結果是否可靠。我們文章已發表2個多月，我們歡迎所有實驗室重複我們的實驗結果並討論。

更有意思的是，付向東教授和Kang Zhang合作的文章中也用到GFAP-Cre的AAV病毒系統進行標記，並聲明能用GFAP-Cre特異性標記膠質穆勒細胞（見下圖）。而且需要指出的是，他們用的是GFAP-Cre+CMV-LSL-RFP 雙AAV病毒系統，我們用的是GFAP-Cre單AAV病毒系統注射到Ai9小鼠中。如果我也來一個「眾所周知」，雙病毒系統比單病毒系統更容易洩露，那我也有理由懷疑這篇文章中的結果存在造假的可能。我是否也可以懷疑他們要麼觀察到了洩露現象而不實報導，要麼沒有觀察到洩露現象而故意抹黑我們，希望他們能夠正面回應一下。

付向東教授Nature文章專利申請號WO2019200129A1，公布時間：2019年10月17日（在我們Cell文章投稿後公布）

https://patents.google.com/patent/WO2019200129A1/en?inventor=xiang-dong+fu

付向東教授Nature文章和專利中都指明在紋狀體（striatum）中幾乎不可能實現多巴胺神經元轉分化：

付向東教授專利中涵蓋的疾病和方法，並沒有涵蓋視神經節細胞轉分化和基因編輯技術：

二、關於本人2013年Cell文章造假部分回應

「這讓我聯想到楊輝在博士後階段發表的「高效插入基因突變方法」研究論文 (詳見Cell 154: 1370-1379， 2013)，遭到領域內科學家廣泛質疑，有20多個獨立實驗室聯合報導不能重複他的實驗結果 (詳見 Genome Biology 20:171, 2019) 。對於其他科學家的質疑，楊輝除了辯稱自己比別人高明，強調實驗條件略有不同外，沒有任何合理解釋，至今我們再也沒有看到他重複自己結果的實驗證據。」

Gurumurthy et al.等在2019年發表的文章中稱我們在2013年Cell文章中製作條件性敲除小鼠的方法效率比文中報導的要低很多，而且比較了幾種製作條件性敲除的新方法。這是很正常的學術爭論，同時我們並不同意文中的一些觀點，也寫信給雜誌社回應了作者，文章正在審稿中，由於疫情原因耽誤了發表，原文如下：

Response to 「Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation」

Hui Yang【1】, Haoyi Wang【2】, Rudolf Jaenisch【3,4】

【1】Institute of Neuroscience, State Key Laboratory of Neuroscience, Key Laboratory of Primate Neurobiology, CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology, Shanghai Research Center for Brain Science and Brain-Inspired Intelligence, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China

【2】State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology, Institute of Zoology, The Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

【3】Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, USA 4Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA.

*Corresponding authors. E-mail: [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]

Gurumurthy et al. [1] recently reported that a method developed by Yang et al. to generate floxed allele (designated as 「two donor method」 by Gurumurthy et al.) [2] had poor reproducibility. They claimed that three centers could not reproduce our results on generating conditional alleles of the Mecp2 locus and that the 「two-donor method」 had very low success rate on other loci.

Here, we provide our responses to these claims:

1. Our results on Mecp2 locus published by Yang et al have been reproduced by independent experiments in the Jaenisch (8-10% correct alleles), Yang (8% correct alleles) and Hatada’s groups (2-6% correct alleles) [3], respectively. In addition, multiple peer-reviewed publications [3, 9-12] have successfully used this method to create conditional knockout (CKO) mice (9 out of 11 loci succeeded, 2.5% to 18% efficiency). We noticed that the efficiency of generating CKO mice by CRISPR/Cas9 could vary, which might due to different platform features or experiment conditions.

2. The conditions used by Gurumurthy et al. [1] do not correspond to the conditions used in our paper. The concentrations of CRISPR reagents used in the Gurumurthy et al.’s study [1] on the Mecp2 locus (10 ng/μl for Cas9 mRNA, 10 ng/μl for sgRNA and 10 ng/μl for oligos) were much lower (10 fold lower RNA and 20 fold lower oligo donor concentration) than those used in the Yang et al.’s experiments (Cas9 100 ng/μl, sgRNA 50 ng/μl and 100 ng/μl for each oligo) [2] and Yang et al.’s previous [4] and following publications [5-8]. It is well known that the concentrations of CRISPR reagents are well correlated with the genome editing efficiency.

3. We utilized piezo-driven zygote injection method in our original paper, which allows for injecting CRISPR components at much higher concentration. The difference between this method and pronuclear injection method used by Gurumurthy et al. might also contribute to the difference of successful rates.

In general, with any genome editing method or strategy being used, the efficiencies at different genomic loci are often highly variable. In the 2013 proof of concept paper, we showed the feasibility of generating floxed allele at Mecp2 locus using CRISPR. To assume the efficiency we demonstrated at Mecp2 locus will be directly translated to the success rate at other genomic loci seems premature.

We agree with the Gurumurthy et al’s comment that the 「one-donor method」 offers higher success rate for generating floxed alleles in general, while the efficiency of 「one-donor method」 is also variable depending on the genomic loci and donor plasmid design. Before the publication of Gurumurthy et al., we also noted this, and developed a 「one-donor method」, termed 「Tild-CRISPR」 method [8], and demonstrated the feasibility and high efficiency in generating CKO mice.

With the fast improvement of genome editing technologies, we and many others constantly optimize our protocols. We welcome all discussions about the choice of optimal strategy for particular applications, however, we think the reproducibility of any published work can only be validated by using the exact same experimental methods and technical parameters.

原文翻譯

Gurumurthy等最近報導說由Yang開發的用於產生floxed等位基因的方法重現性較差(Gurumurthy指定該方法為「雙供體法」) [1-2]。他們聲稱有三個實驗中心無法重複在Mecp2位點產生條件等位基因的結果，同時「雙供體法」在其他位點的成功率非常低。

在這裡，我們對Gurumurthy等的說法解釋如下：

1．我們在Mecp2位點的結果已經被三個不同的實驗室分別重複出來：Jaenisch實驗室(8-10%正確等位基因)、Yang實驗室(8%正確等位基因)和Hatada實驗室(2-6%正確等位基因)[3]。此外，多篇同行評議論文已經成功地使用該方法創建了條件敲除(CKO)小鼠(11個基因中有9個成功，效率為2.5% - 18%不等)[3,9 -12]。我們認為CRISPR/Cas9生成CKO小鼠的效率之所以存在差異，這與平臺技術或實驗條件的不同有關。

2．眾所周知，基因組編輯效率與CRISPR試劑的濃度密切相關。而Gurumurthy等使用的CRISPR試劑的濃度條件與我們文章中使用的條件不一致[1]，Gurumurthy等使用的注射材料的濃度比我們要低得多(10-20倍差異) [5 -8]，具體如下表所示。

3．在我們2013年的論文中，我們使用piezo驅動的受精卵注射法，該方法允許進行高濃度的CRISPR組份注射。而該方法與Gurumurthy等人使用的原核注射方法不同，這可能也是成功率不同的原因。

一般來說，任何基因組編輯方法或策略在不同基因組位點的效率往往是高度不同的。在2013年的文章中，我們展示了利用CRISPR在Mecp2位點生成floxed等位基因的可行性，但並不能直接轉化為在其他基因組位點上也可以獲得相似的成功率。

我們同意Gurumurthy等的觀點，即一般情況下「單供體方法」在產生floxed等位基因方面展示了更高的成功率，但「單供體方法」的效率也取決於基因組位點和供體質粒設計等因素。在Gurumurthy等的工作發表之前，我們也注意到了這一點並開發了一種名為Tild-CRISPR的「單供體方法」 [8]，並證明此方法可以高效方便地生成CKO小鼠。

隨著基因編輯技術的快速發展，我們和其他同行在不斷優化我們的策略。我們歡迎所有關於特定情況下選擇最佳策略的討論。但我們認為，任何已發表工作的再現性只能通過使用完全相同的實驗方法和技術參數來進行驗證。

評判生物實驗結果真實性很重要的一點是可重複性。既然有許多實驗室已經通過我們的方法重複出相同的結果，就不能定義我們的文章是造假。生物實驗的複雜性使得任何一個關鍵因素的差別都可能會極大影響實驗結果。如果一些實驗室因為各種原因無法重複我們的實驗，就忽視重複出我們實驗的課題組，並斷定文章造假，那麼任何一個引用率高的文章都可能會被冠以造假的頭銜。

參考文獻：

1.Gurumurthy CB, O'Brien AR, Quadros RM, Adams J, Jr., Alcaide P, Ayabe S, Ballard J, Batra SK, Beauchamp MC, Becker KA, et al: Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biol 2019, 20:171.

2.Yang H, Wang H, Shivalila CS, Cheng AW, Shi L, Jaenisch R: One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 2013, 154:1370-1379.

3.Horii T, Morita S, Kimura M, Terawaki N, Shibutani M, Hatada I: Efficient generation of conditional knockout mice via sequential introduction of lox sites. Sci Rep 2017, 7:7891.

4.Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013, 153:910-918.

5.Yang H, Wang H, Jaenisch R: Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc 2014, 9:1956-1968.

6.Yao X, Wang X, Hu X, Liu Z, Liu J, Zhou H, Shen X, Wei Y, Huang Z, Ying W, et al: Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Res2017, 27:801-814.

7.Yao X, Liu Z, Wang X, Wang Y, Nie YH, Lai L, Sun R, Shi L, Sun Q, Yang H: Generation of knock-in cynomolgus monkey via CRISPR/Cas9 editing. Cell Res 2018, 28:379-382.

8.Yao X, Zhang M, Wang X, Ying W, Hu X, Dai P, Meng F, Shi L, Sun Y, Yao N, et al: Tild-CRISPR Allows for Efficient and Precise Gene Knockin in Mouse and Human Cells. Dev Cell2018, 45:526-536 e525.

9.Pritchard CEJ, Kroese LJ, Huijbers IJ: Direct Generation of Conditional Alleles Using CRISPR/Cas9 in Mouse Zygotes. Methods Mol Biol 2017, 1642:21-35.

10.Bishop KA, Harrington A, Kouranova E, Weinstein EJ, Rosen CJ, Cui X, Liaw L: CRISPR/Cas9-Mediated Insertion of loxP Sites in the Mouse Dock7 Gene Provides an Effective Alternative to Use of Targeted Embryonic Stem Cells. G3 (Bethesda) 2016, 6:2051-2061.

11.Ma X, Chen C, Veevers J, Zhou X, Ross RS, Feng W, Chen J: CRISPR/Cas9-mediated gene manipulation to create single-amino-acid-substituted and floxed mice with a cloning-free method. Sci Rep 2017, 7:42244.

12.Nakagawa Y, Sakuma T, Nishimichi N, Yokosaki Y, Yanaka N, Takeo T, Nakagata N, Yamamoto T: Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open 2016, 5:1142-1148.

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