中科院動物所譚錚研究組創建新技術，活細胞中檢測四鏈核酸結構

2020-10-17 BioArtReports


責編 | 十一月


富含鳥嘌呤的單鏈DNA或者RNA可以形成一種G-四鏈體的四鏈核酸高級結構。具有潛力形成G-四鏈體的序列主要分布於染色體端粒區、DNA 複製起始區、基因啟動子區以及 mRNA 翻譯起始區。研究表明G-四鏈體與端粒調控、DNA 複製、基因轉錄調控及蛋白翻譯調控密切相關。


序列預測發現染色體DNA中能夠形成G-四鏈體的序列數量非常龐大，但由於檢測活細胞G-四鏈體的手段匱乏，並且染色體DNA除端粒末端約200個鹼基外都是雙鏈配對狀態，人們對細胞中是否存在G-四鏈體一直非常關心。


近10年來，科學家們付出了很多努力，比如篩選G-四鏈體特異性抗體、合成結合G-四鏈體的螢光分子，來證明細胞中G-四鏈體的存在。這些研究從不同角度驗證了G-四鏈體在細胞內存在，但是能夠在活細胞中高解析度地檢測並定位染色體G-四鏈體的技術仍然缺乏。近年來有文獻報導使用G-四鏈體抗體(BG4)和ChIP-seq技術來檢測染色體DNA上的G-四鏈體。然而，由於活細胞內的還原環境不利於抗體二硫鍵的形成，使用抗體來檢測細胞內G-四鏈體需要將細胞進行甲醛固定、透化或裂解，然後才能夠加入抗體去結合靶標。這個過程一方面破壞了維持G-四鏈體的細胞內環境，另一方面甲醛將G-四鏈體和內源G-四鏈體結合蛋白交聯在一起，剩下可以被抗體結合併檢測到的G-四鏈體非常少。


理想的G-四鏈體檢測方案是在細胞內表達一個特異性識別G-四鏈體的蛋白，這個蛋白需要滿足以下幾個特徵：1）結構簡單，不包含與其他蛋白發生相互作用的結構；2）對G-四鏈體識別的特異性高；3）對G-四鏈體結合的親和力足夠高，能夠與內源蛋白競爭結合G-四鏈體。


為了達成這一目標，中國科學院動物研究所等單位的團隊從天然G-四鏈體結合蛋白中篩選出結合G-四鏈體的肽段，以此為基礎製備了一個高親和力高特異性識別G-四鏈體的僅有64個胺基酸的人工蛋白（G4P）。該蛋白的核心包含兩段來源於天然RHAU蛋白的短肽，分別可以與G-四鏈體的上下兩個鳥嘌呤平面結合（圖1）。


圖1. G4P蛋白的胺基酸組成（A）以及與G-四鏈體結合的模式圖（B）。


該工作發表於2020年10月在線發表於Nucleic Acids Research 上，題為Detection of genomic G-quadruplexes in living cells using a small artificial protein，創建出了活細胞中檢測G-四鏈核酸結構的技術。



G4P蛋白對多種類型的G-四鏈體均具有非常高的親和力，G4P蛋白可以融合入核信號肽和抗體識別標籤，並保持其對G-四鏈體識別和結合的能力，因此非常適合於檢測活細胞內的G-四鏈體。本研究採用經典的ChIP-seq技術，在人A549、293T、Hela-S3、NCI-H1975、小鼠3T3、雞DF1細胞系中成功檢測到G-四鏈體的形成。結果發現G-四鏈體主要分布於基因轉錄相關區域，說明G-四鏈體的形成和基因轉錄的關係非常密切。這些高等動物細胞染色體DNA上有數千到數萬個G-四鏈體形成位點，其中人A549細胞中數量最多（信號富集倍數大於5的位點數43752個），分布於60%以上的基因啟動子區域以及70%以上的基因中。


該研究進一步比較G4P與天然G-四鏈體相關蛋白在DNA富集的信號分布狀態以及它們在染色體上的坐標位點。結果發現，在四種人的不同細胞系中，G4P蛋白的信號熱圖分布趨勢相似，局部區域信號強度存在差異。天然G-四鏈體結合蛋白以及胞嘧啶單鏈DNA結合蛋白在染色體上的結合區域與G4P結合區域一致。這個結果驗證了基於G4P的ChIP-seq技術可以在細胞內準確檢測到天然G-四鏈體形成的位點。


該團隊曾經在雙鏈DNA中G-四鏈體的形成機制上開展了一系列研究，發現轉錄產生的DNA負超螺旋是驅動G-四鏈體在雙鏈DNA中形成的一種機制（Zhang C 2013，Zheng 2017, Xia 2018 ）。本研究分析並比較了通過G4P-ChIP-Seq技術繪製的G-四鏈體圖譜和國外科學家研究報導的DNA負超螺旋的分布圖譜。結果發現G-四鏈體和負超螺旋形成位點都集中分布於轉錄起始位點附近，並且DNA負超螺旋和G-四鏈體形成位點的坐標幾乎重疊。這個結果證實了DNA負超螺旋驅動G-四鏈體形成的機制。


本研究使用G-四鏈體特異性識別蛋白繪製了高等動物細胞染色體上的G-四鏈體圖譜，G-四鏈體在細胞中的存在也得到進一步證實。G-四鏈體在染色體中分布範圍之廣超出預期，它在基因轉錄過程中的功能可能一直被低估。該工作中創建的G-四鏈體檢測技術即將開啟更多類型高等動物細胞染色體的G-四鏈體圖譜的檢測，以G-四鏈體為代表的DNA二級結構在染色體中的功能將進一步揭曉。


據悉，中山大學藥學院（深圳）副教授鄭克威、中國科學院高能物理所助理研究員張佳宇、中山大學生命科學學院博士後何意得為該論文並列第一作者，中國科學院動物研究所譚錚研究員為該論文通訊作者。

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