作者：蘭州大學第二醫院骨科 馬崇文
關節軟骨損傷一直以來是骨科比較棘手的問題之一，因為軟骨缺乏血供，缺乏能遷移、增殖及參與修復反應的未分化細胞等因素，導致關節軟骨修復能力有限，關節軟骨損傷後的修復主要表現為瘢痕形成與軟骨增厚，這種修複方式會大大增加其發展成骨關節炎的風險。目前臨床上治療關節軟骨損傷的方法有多種，主要包括微骨折法、自體骨軟骨移植、同種異體軟骨移植及自體軟骨細胞移植技術。與傳統方法如自體骨軟骨移植相比，自體軟骨細胞移植術（ACI）可以產生較多的透明軟骨樣修復組織，具有更好的臨床效果。
自BrittbergM等於1987年第一次提出ACI技術以來，全球已經有超過20000例患者接受這種治療，目前ACI技術經過一、二代的不斷創新及優化，已發展至第三代技術：基質誘導自體軟骨細胞移植術（MACI），這是將軟骨細胞種植於生物支架材料上，再將其按軟骨缺損區剪裁後匹配覆蓋缺損區。第三代ACI技術與第二代的不同點在於其事先將軟骨細胞與載體結合，再植入軟骨缺損區，這種載體技術的運用就解決了第二代ACI技術的細胞滲漏、細胞去分化的問題，同時這種載體作為一種細胞支架，充當的是臨時基質的作用，其不僅可以供細胞增殖和細胞外基質沉積，還可釋放各種生長/分化因子主動參與再生過程。
目前常用的載體材料有天然材料、生物陶瓷、人工合成高分子聚合物等幾大類。然而，這些支架材料的長期安全性和有效性仍然存在一些問題。合成聚合物可能存在原位保留和退化的潛在問題，生物材料可能攜帶的病原體有傳播及啟動免疫反應的風險。因此，為了儘量減少未知的風險，如果支架在整個治療過程中可以避免使用，就可免除這方面的顧慮，但是如何在不使用支架的同時，又能促進細胞增殖以及將修復組織整合到軟骨受損部位又成為了新的問題。為了解決這些問題，一種新的「無支架-基於間充質幹細胞的輸送系統」慢慢興起，這種技術被視為新一代軟骨損傷修復的幹細胞療法而受到了大批研究人員和臨床醫生的青睞，以下對這一技術的研究進展作一綜述。
間充質幹細胞（MSC）的特性及選擇
國際細胞治療協會已經定義了MSC的統一鑑定標準：當維持在標準培養條件下時，它們必須是貼壁細胞；他們必須表達CD105、CD73和CD90；它們必須缺乏CD45、CD34、CD14（CD11b）、CD79a（CD19）和HLA-DR的表面表達，並且必須能夠分化成中胚層譜系的細胞。MSC可分化為軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞，並且可以從各種組織分離，如骨髓、滑膜、脂肪組織和骨骼肌。來源於骨髓的間充質幹細胞作為幹細胞療法的細胞來源被廣泛研究並應用於臨床，然而，骨髓的抽吸是具有侵入性的程序，往往需要麻醉，並經常會有併發症產生。2001年，DeBari等人發現來源於人滑膜的滑膜間充質幹細胞。有多項研究表明，滑膜MSCs多能性不受供體年齡或細胞傳代的影響，且與其他組織MSCs相比具有最大的成軟骨潛能。據報導，來自骨關節炎或類風溼性關節炎患者的滑膜MSCs並不比來源於創傷患者的差。為了收穫滑膜，需要關節鏡手術，但是手術的創傷遠小於骨髓穿刺，因為關節鏡手術醫生通常會在關節鏡下切除滑膜以獲得清晰的術野。因此，滑膜間充質幹細胞是利用組織工程修復軟骨損傷的最有吸引力的細胞來源之一。
體外培養無支架TEC
Yasui等發現在富含抗壞血酸的培養基中，MSCs可以產生大量的膠原基質，隨後，單層細胞基質在生長培養基中變成僵硬的片狀結構，使用移液管並施加輕微的剪切應力就可將其從中很容易地分離出來。分離後，這個由滑膜間充質幹細胞及其產生的細胞外基質構成無支架-三維組織工程構建體（TEC）開始主動收縮並逐漸增厚，其內部無明顯的極性，具有可摺疊性、收縮性並且可塑性極強，接著在含有BMP2的軟骨細胞培養基中進行軟骨分化，產物均表達軟骨特異性標誌物II型膠原（COL2A1），聚集蛋白聚糖（ACAN）和SOX9，證明此TEC為MSC提供了合適的3D微環境促使其向軟骨細胞分化。Yasui等還提出在低氧張力（LOT）條件下可促進TEC向軟骨分化並可防止幹細胞的衰老。實驗表明在低氧張力條件下（5％O2；LOT-TEC），從人滑膜MSCs製備的TEC顯示軟骨形成標誌基因表達水平明顯升高。值得注意的是LOT-TEC可分化為直徑約25px透明樣軟骨組織，且未檢測到纖維組織的存在，而傳統的軟骨細胞培養則是分化成透明樣和纖維樣軟骨組織的混合物，這也是第一次證明體外可在無支架條件下培養出可植入大小軟骨組織，也預示著將來的自體軟骨細胞移植將不再使用外源性支架。
研究表明，在無支架組織工程軟骨構建體中，若膠原含量不足，在摩擦剪切力的情況下容易出現表面剝落，增加複合體中的膠原蛋白含量是必要的，Whitney等發現適當劑量的甲狀腺激素T4能夠明顯增加無支架-細胞複合物中II型膠原蛋白含量，且不伴隨I型或X型膠原的增加，表示其直接增加透明軟骨的形成而並未誘導終末分化；Ylarinne等發現在高滲條件下，TEC中II型膠原表達水平顯著增高，並提出在20%O2張力下使用的高滲高糖培養基是對無支架-細胞複合物體外培養的最有益的組合，本文討論的無支架-基於間充質幹細胞的TEC促進MSC向軟骨細胞分化也主要表現為軟骨細胞標記物II型膠原表達的升高，這些研究對於體外培養的無支架複合物最終向軟骨細胞分化有重要的參考和研究意義。
無支架-基於滑膜間充質幹細胞TEC的臨床試驗
由於關節軟骨的基質組織顯示出獨特的抗粘附特性，因此，植入的組織與鄰近的軟骨基質的整合已成為治療首要難題。為了克服這個問題，大多數修復軟骨損傷的植入手術需要對軟骨基質表面進行酶處理，或通過縫合加固等方法，但是，這種由於酶解或是縫線未吸收所造成的組織缺陷可能成為植入物和鄰近軟骨組織周圍基質退化降解的開關。因此，為了避免這種潛在的併發症，若植入物可以和原生軟骨組織高度粘附則更加安全。Shimomura等為了測試TEC粘附性質，將其置於解凍的新鮮冰凍人軟骨碎片表面，結果顯示TEC在5min內就粘附在軟骨碎片上。7d後進一步培養TEC-軟骨複合物，組織學顯示它們始終保持穩定結合，免疫組化顯示TEC和軟骨碎片的接觸面間產生纖連蛋白和玻連蛋白，表示Tec與軟骨組織間的緊密結合。Yasui等於2013年開始進行TEC體內臨床試驗（進行中），納入病例為軟骨病變≥125px2，年齡20~60歲的有膝關節症狀的軟骨損傷患者。TEC製備過程採用低氧張力培養基。在移植前，TEC的形狀被修整到與軟骨病變的缺損形狀相匹配，移植過程未採用任何縫合或膠水固定。初步結果表明，TEC移植可以通過軟骨樣修復組織完全覆蓋軟骨缺損，且具有較高的T2加權成像圖，從而恢復了正常的關節功能。無支架-基於滑膜間充質幹細胞的TEC作為一項新興的自體軟骨細胞移植技術，目前臨床試驗正在國內外逐漸開展，將來會有更多的關於臨床方面的數據來進一步支持現有的研究成果。
展望
來自於滑膜的細胞具有極高的自我更新能力和表面抗原穩定表達，通過4~7代培養即可觀察到類似骨髓來源的間充質幹細胞。此外，這些細胞保留了成骨性、成軟骨性和成脂性分化的能力。因此體外培養的TEC可以被視為基於MSC的3D生物組織工程產物，未使用任何類型的外源性支架構建三維組織工程構建體是該技術的核心，其主要依賴於培養的單層細胞/基質複合物的主動收縮。作者關注的核心在於TEC沒有任何外源性支架的介入，因此TEC的植入將由外源性支架構成的潛在副作用的風險降為零。TEC的結構優勢表現在滑膜間充質幹細胞及其產生的基質構成的複合物組織構型為分布均勻的三維結構，因此，儘管TEC不含有人造支架，其仍具有很強的支撐性，研究表明在2~3周時的TEC結構的拉伸強度與損傷後1~2周的癒合韌帶組織的拉伸強度相當。同時，TEC具有很強的組織粘附性，這種性質有助於TEC快速牢固的粘附到天然軟骨基質上，有助於原位修復。值得注意的是，TEC本來不含軟骨形成的標記分子，如膠原II，而是富含膠原I和III。然而，在植入體內後，沒有接受離體刺激成軟骨分化的基本TEC似乎對內源性環境有反應，其基質複合物可演變成軟骨組織。若可在體外複製TEC移植入體內後產生，或許會產生更多正面影響，如在體外利用低氧張力培養基並且聯合甲狀腺激素T4後以及氧張力聯合T4時不同比例濃度配比對TEC的成軟骨分化會有何影響，還值得今後繼續深入探究。
小結
幹細胞療法修復軟骨損傷是一種極具發展潛力的方法，在大多數基於幹細胞的軟骨損傷修復中，由外源性支架材料構建適合植入物增殖分化的微環境的技術被廣泛應用。然而，無支架方法在長期安全性方面更具有優勢，由滑膜間充質幹細胞自身合成的細胞外基質充當內源性3D支架的角色，幫助TEC分化為軟骨細胞並產生軟骨基質，可以更加有效的還原受損部位為原生軟骨組織形態，對於運動員等高需求人群來說具有重大意義。同時，間充質細胞的來源途徑很多，例如脂肪來源的間充質幹細胞，因獲取方式更為簡便，會是將來的研究熱點。總的來說，無支架-基於間充質幹細胞的軟骨修復技術展示出令人期待的前景。
來源：中國矯形外科雜誌2018年6月第26卷第12期
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