首例催化Alder-ene反應的酶及其周環選擇性的精準控制

點評 | 戈惠明（南京大學），雷曉光（北京大學）

周環反應是指具有環狀過渡態的協同反應，這類反應在天然產物的有機合成中常常被應用於一步構建多個碳碳鍵，而且具有較好的立體選擇性和區位選擇性。酶的周環選擇性(periselectivity)是指反應物可能發生兩類或以上的周環反應，但在特定酶的催化下，反應物更傾向於產生某一類周環反應的產物。最近，催化周環反應的酶(以下稱為周環酶)作為酶學研究的一個熱點，吸引了許多研究者的關注【1】。

2020年9月30日，加州理工大學洛杉磯分校(UCLA)的唐奕課題組、Kendall N. Houk課題組與中科院上海有機所的周佳海課題組合作在Nature上發表了文章An enzymatic Alder-ene reaction，首次表徵了自然界中催化Alder-ene反應的酶及其催化氧雜Diels-Alder（DA）反應的同源蛋白。他們根據晶體信息和計算指導，通過定點突變實現了周環選擇性的逆轉，並深入討論了兩種酶如何利用幾乎相同的活性位點實現周環選擇性的精準控制。

根據之前唐奕課題組報導的真菌天然產物leporin C的生物合成途徑【2】，他們推測在天然產物pyridoxatin (1)和cordypyridone (2)的生物合成途徑中，核心部分烯基環己烷砌塊可能是由活性中間體quinone methide(以下簡稱為QM)【3】通過Alder-ene反應產生的；而天然產物asperpyridone A (3)和fusaricide (4)中的吡啶酮核心砌塊，可能是由活性中間體QM (7)也可發生氧雜DA反應產生的。通過分析pyridoxatin和fusaricide的生物合成基因簇【4,5】，他們發現都含有編輯O-甲基轉移酶(以下簡稱為OMT)的基因(adxI/epiI)。鑑於之前周環酶LepI的序列和OMT也具有較高的序列同源度，因此他們推測AdxI和EpiI都是潛在的周環酶。另外，在其他真菌菌株中，也存在與AdxI和EpiI同源的OMT，包括PdxI、ModxI、UpiI和HpiI。

體外測活實驗發現在PdxG和輔酶NADPH的存在下，化合物5的C7上的羰基可以被還原成羥基，羥基產物6也可以自發地發生O4-雜DA反應和Alder-ene反應，產物比例為3:1。當5和PdxG、NADPH以及AdxI/PdxI/ModxI共同孵育時，主要生成Alder-ene產物8(>98:2, 8:9)；但與EpiI/UpiI/HpiI孵育時，主要產物為O4-雜DA產物9(<5:95, 8:9)。這說明以上六種酶均可以催化脫水反應生成(Z)-QM (7)，但接下來催化的反應具有不同的周環選擇性，AdxI/PdxI/ModxI催化的是Alder-ene反應，EpiI/UpiI/HpiI催化的是氧雜DA反應。

計算表明，在自發狀態下，Alder-ene反應的能壘更高，所以在未加入酶的時候，化合物7主要生成的是氧雜DA反應的產物，但在PdxI等酶的催化下主要產物卻為Alder-ene產物。為了深入理解酶催化的Alder-ene反的機理，他們解析了PdxI的母體結構以及與底物類似物5和產物8的複合物晶體結構。複合物的晶體結構和母體結構極為相似，說明底物結合併沒有引起蛋白構象較大變化。PdxI-5複合物結構的結合口袋中，吡啶酮環與H161、Q412和K337有直接的氫鍵作用，與T232間接通過一個水分子形成氫鍵作用。化合物5的長側鏈處於伸展的狀態，並沒有呈現預組織構象。化合物5作為底物類似物，C7上的羰基和C4上的羥基朝向同一個方向，這表明K337作為一般鹼進行催化的脫水反應立體選擇性為syn式，因此產生的是(Z)式脫水產物。突變體K337A導致酶失去脫水活性也進一步驗證了K337在脫水反應中的關鍵作用。

鑑於K337是作為鹼來催化脫水反應的，所以他們在分子動力學模擬(以下簡稱為MD)的模型中把K337的側鏈模擬成銨根離子。在500ns的MD中，底物的側鏈在50-100ns時會形成預組織構象。在所有的MD中， K337與7中C4上的羰基的氫鍵時間最為持久，這說明質子化的K337可能是通過氫鍵催化來促進Alder-ene反應的。他們還通過殘基部分側鏈的理論酶(theozyme)模型來研究K337和H161氫鍵作用對反應速率的影響。使用甲基銨根離子來模擬K337，咪唑陽離子來模擬H161，計算結果顯示Alder-ene反應經過TS-4的能壘在酶的促進下降低了11.7 kcal/mol，即速率加快了108。這很可能是因為酶對C4上羰基的質子化導致C7高度親電，降低了C4羰基氧的親核性，這也抑制了O4-雜DA反應的過渡態(TS-4)。這個理論酶模型還揭示了經過TS-5的O2-雜DA反應比O4-雜DA反應更有利，但化合物11在PdxI體外酶活實驗中並未觀察到。將TS-6對接到PdxI中，可以發現T232與TS-6的C14有著位阻作用。T232相當於一面位阻牆，阻止了TS-6構象的形成。為了驗證這個假設，他們使用T232A/S突變體進行體外測活實驗，果然觀察到了化合物11的產生。

PdxI中的關鍵殘基K337在EpiI/HpiI/UpiI中是保守的，但EpiI/HpiI/UpiI催化的是O4-雜DA反應。為了解釋EpiI/HpiI/UpiI的催化機理和周環選擇性，他們解析了apo-HpiI和HpiI-5的晶體結構。Apo-HpiI和apo-PdxI高度相似，HpiI-5和PdxI-5結構中，除了PdxI的V413和HpiI的M415，活性口袋其他胺基酸都是保守的。這個殘基位於吡啶酮環結合位點的下方，與PdxI中的K337和HpiI中的K339鄰近。HpiI-5的複合物結構清楚地表明了K339與吡啶酮C4上的羥基沒有氫鍵作用。突變體K337A也保留了80%的催化活性，而且周環選擇性和野生型是一樣的。因此，HpiI催化的反應並不需要C4羥基與蛋白之間的氫鍵作用。從HpiI的晶體結構還可以看出，這個氫鍵的消失是由於M415的位阻壓迫，導致K339的側鏈遠離底物。同樣的，EpiI和UpiI中該甲硫氨酸都是保守的，而AbxI和ModxI的纈氨酸也是保守的。

在晶體結構信息的基礎上，他們探究了PdxI的周環選擇性能否通過將V413突變成位阻較小的胺基酸發生變化，發現將V413突變成位阻比甲硫氨酸小的丙氨酸或絲氨酸，可以保留PdxI催化Alder-ene反應的活性；而突變體V413M可以將不同周環反應的產物8與9的比例從>98:2變為40:60。相反，將EpiI的M411突變成位阻較小的纈氨酸或半胱氨酸可以將產物比例(8:9)從5:95變為25:75。M411的突變並不能完全改變周環選擇性，這說明其他殘基對周環選擇性也有貢獻。

從HpiI-5的複合物結構可以推斷，底物7的構象靈活性受M411和T231控制的。EpiI突變體T231A/S能提高底物的構象靈活性，使其能和K338形成氫鍵，有利於Alder-ene反應的發生。T231A/S的確提高了Alder-ene產物8的比例，也提高了O2-雜DA產物11的比例。有趣的是，雙突變體M411V/T231A逆轉了周環選擇性，主要產物變成了Alder-ene產物(66:33, 8:9)。其他減小位阻的突變體M411V/T231S, M411T/T231A, M411C/T231A, M411G/T231A都有相同的周環選擇性。因此，將M411和T231變成更小的殘基後可以擴大酶的活性口袋，讓底物7的構象更有利於C4羰基的質子化，從而導致了周環選擇性的改變。

結合生化實驗、晶體結構和計算結果，他們確證了PdxI/AdxI/ModxI可以催化立體選擇性的syn-脫水和接下來的Alder-ene反應，且反應是具有立體、區位和周環選擇性的。EpiI/UpiI/HpiI催化的同樣是syn-脫水，但接下來催化的是氧雜DA反應。以PdxI和EpiI為代表，PdxI利用K337通過氫鍵催化促進能壘較高的Alder-ene反應，但在EpiI中，活性口袋中的M411使K337與底物的氫鍵作用失去所以主要發生O4-雜DA反應。另外，PdxI中的T232和EpiI中的T231有位阻效應，控制了氧雜DA反應的區位選擇性，抑制了O2-雜DA產物11的形成。

PdxI/AdxI/ModxI、EpiI/UpiI/HpiI這兩組同源性的周環酶，因為進化上的細微分歧導致了不同的周環選擇性，產生了不同的天然產物。這一工作不僅加深了對周環反應酶的催化機制理解，也為探索催化Alder-ene反應和雜DA反應的新型生物催化劑提供了新的啟示。

唐奕課題組的博士後Masao Ohashi、博士生Cooper S. Jamieson和周佳海課題組的博士生蔡毓娟並列論文第一作者。該工作中晶體衍射數據是在上海光源BL17U1和國家蛋白質設施BL18U1 、BL19U1收集的。

專家點評

戈惠明（南京大學生命科學學院，教授）

周環反應是一類同時伴隨化學鍵斷裂和形成的協同反應，其反應過程中並不產生自由基或離子等活性中間體，一般只需要加熱或光照，即可分別產生高度立體選擇性的產物，是高度空間定向反應。在有機合成中通常利用周環反應構建C-C鍵或C-雜原子鍵以形成高度立體選擇性產物。

自2011年劉鴻文課題組首次鑑定出能夠催化Diels-Alder（DA）反應的周環酶SpnF後，世界各地科學家先後從多種天然產物的生物合成途徑中鑑定出了新型DA酶，譬如，在pyrroindomycins生物合成中能夠級聯催化兩步DA反應的PyrE3和PyrI4 (Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 259)；可催化高階[6 + 4]環加成反應的StmD (Nature 2019, 568, 122)；可以催化逆電子需求DA反應的LccD (J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 5659)；甚至在聚醚合成途徑中也發現了意料之外的可催化逆電子需求雜DA反應的Tsn15 (Nat. Catal. 2019, 2, 1045)。前期，加州大學洛杉磯分校(UCLA)的唐奕課題組，鑑定出一種SAM依賴的多功能周環酶LepI，能夠同時催化分子間DA反應、雜DA反應和逆克萊森重排反應(Nature 2017, 549, 502)。隨後通過上海有機所周佳海課題組解析了LepI與不同底物的高分辨共晶數據，結合Kendall Houk課題組的理論計算工作，系統地闡述了LepI催化的分子機制(Nat. Chem 2019, 11, 812)。雖然近十年間周環酶被不斷發掘和鑑定，然而如何控制其發生的反應類型和立體構型仍然是一個難點。

近日，唐奕課題組、Kendall Houk課題組與周佳海課題組合作，以LepI為基礎，鑑定出6個類似蛋白，結合各自天然產物結構推測，部分可催化Alder-ene反應，另一部分可催化氧雜DA反應。通過體外酶學發現並驗證三個酶可加速催化生成Alder-ene的產物，而其餘三種酶可加速催化生成與LepI類似的氧雜DA反應。通過PdxI晶體結構解析和酶動力學模擬，發現K337可作為general base來催化脫水反應，它的突變導致脫水活性喪失，此外底物中吡啶酮環與H161和K337的氫鍵作用使得能壘降低了11.7 kcal/mol，並朝向Alder-ene方向進行。同時計算表明，反應過程中O2-雜DA反應比O4-雜DA反應更有利，通過將T232突變成A/S以降低空間位阻，成功地觀測到11的產生。然而在其他催化O4-雜DA反應的酶中，該關鍵殘疾K337是十分保守的，為進一步解釋周環選擇性，通過對Hpil的晶體結構解析，發現其與PdxI高度相似，僅在PdxI的V413殘基對應位置變成了M415，正是由於該胺基酸殘基的改變，增加了空間位阻使得K339遠離底物，無法形成氫鍵。將V413突變成比甲硫氨酸小的殘基可保留Alder-ene反應活性，突變成甲硫氨酸則使得不同周環反應產物比例從>98:2變為40:60。相反，在Hpil中單一降低M411的位阻並未逆轉周環選擇性，而將此前具有位阻效應的T231進行突變，產生M411V和T231S雙突變株後則逆轉周環選擇性，使得主產物變為Alder-ene產物。

該研究不僅進一步拓展了周環酶的反應選擇性，其催化機制的清晰闡明和反應選擇性的改造為後期應用奠定了基礎。隨著對周環酶的不斷深入理解，其在天然產物生物合成途徑中的重要性與日俱增。

專家點評

雷曉光（北京大學化學與分子工程學院教授，北大-清華生命科學聯合中心高級研究員）

周環反應常常被用於碳-碳鍵的構造，在化學合成中具有重要的應用價值。在天然產物生物合成途徑中，周環反應扮演著重要的角色，它能一步構建多個手性中心，迅速提高天然產物結構的複雜度，挖掘自然界中存在的能夠催化周環反應的酶對於理解天然產物生物合成途徑以及設計複雜天然產物的高效和精準合成的新方法具有重要的作用，因此，越來越多的科學家關注到這一領域。目前，已經報導的周環反應酶（pericyclase）包括[4+2] pericyclases (例如,SpnF, MaDA), [6+4]/[4+2] bispericyclases (例如 NgnD)，copeases(例如FamC1)，但自然界中是否存在催化Alder-ene反應的酶還未見報導。

2017年唐奕課題組在黃麴黴（Aspergillus flavus）中鑑定出天然產物leporin的生物合成基因簇，其中SAM依賴酶LepI催化了包括氧雜-Diels-Alder反應在內的多個周環反應。通過基因組挖掘，在其他幾種真菌中也能找到類似的基因簇，但不同基因簇產生的天然產物骨架結構並不相同。在天然產物fusaricide的生物合成過程中涉及到氧雜-Diels-Alder反應，而天然產物pyridoxatin的骨架則是由Alder-ene反應參與形成的。基於作者前期對酶催化氧雜D-A反應的理解，他們認為這兩類天然產物生物合成過程中的環化反應是由基因簇中O-MT-fold enzymes催化的。

基於此假設，唐奕課題組對生物合成基因簇中的O-MT-fold enzymes進行了外源表達和功能驗證，他們發現，儘管這些蛋白具有很高的序列相同性，但在功能上可以分為兩類：PdxI, AdxI, ModxI催化了Alder-ene反應，EpiI, UpiI, HpiI催化氧雜-D-A反應。為了理解這些同源蛋白如何控制周環反應的選擇性，上海有機所的周佳海課題組解析了Alder-ene反應酶PdxI以及氧雜D-A反應酶HpiI的apo晶體結構，同時他們也得到了這兩個酶與底物類似物以及產物的共晶結構。在此基礎上，Houk課題組對Alder-ene反應酶PdxI催化體系進行了DFT理論計算、分子對接以及動力學模擬，揭示了K337通過與底物形成氫鍵相互作用降低了Alder-ene反應所需的活化能，使得環化朝著Alder-ene反應的方向進行。在氧雜D-A反應酶HpiI與底物的共晶結構中，雖然HpiI相應的賴氨酸K339非常保守，但是並不能與底物形成氫鍵，因此氧雜-D-A反應的活化能低於Alder-ene反應的活化能，所以HipI可以選擇性地催化氧雜-D-A反應。

通過比較這兩種不同的周環反應酶，作者發現PdxI和HpiI的活性空腔僅有一處胺基酸殘基不同，PdxI中的V413在HpiI中是M415。通過與其他的周環反應酶進行序列比對，作者發現V413在Alder-ene反應酶中是保守的，而M415在所有的氧雜-D-A反應酶中是保守的。因此作者推測，該位點可能控制了周環反應酶的選擇性。隨後，通過將PdxI中V413突變成體積更大的M，作者發現PdxI的功能發生了改變，從特異性催化Alder-ene反應的進行變成主要催化氧雜-D-A反應的發生，從而證明了V413控制了該類周環反應酶的Alder-ene反應選擇性。同樣，在HpiI中將M415突變成體積更小的V，HpiI催化Alder-ene反應的能力大大提高。由此，作者證明了該位點對於這類O-MT-fold enzymes控制周環反應的類型至關重要。與此同時，作者還發現氧雜-D-A反應酶EpiI 中T231可以穩定底物構象，阻礙K338與底物形成氫鍵，從而促進氧雜D-A反應的進行。

總之，通過比較產生不同骨架天然產物的生物合成基因簇，作者在真菌中找到了一類全新的周環反應酶，這類酶利用相同的生物合成中間體，精準控制周環反應的類型，從而實現天然產物的結構多樣化。通過基於蛋白結構的分子動力學模擬以及突變實驗，作者闡明了這類酶的催化機制，也為設計和應用催化Alder-ene反應和雜DA反應的新型生物催化劑提供了新的啟示。該工作是天然產物生物合成以及新機制酶學研究領域的一項重大科研突破，將為多環化合物的高效、精準合成提供新的酶催化工具。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2743-5

參考文獻

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2.Jamieson, C. S., Ohashi, M., Liu, F., Tang, Y.& Houk, K. N. The expanding world of biosynthetic pericyclases: Cooperationof experiment and theory for discovery. Nat. Prod. Rep. 36,698–713 (2019).

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