多光子顯微鏡中的焦點深度擴展方法

雙光子雷射掃描顯微鏡結合鈣指示劑是活體神經元信號探測的金標準。神經網絡中的神經元分布在三維空間中，監測它們的活動動態需要一種能夠快速提高體積成像速率的方式。但是，使用光柵掃描多光子顯微鏡對大量圖像進行成像，如果採用高數值孔徑（NA）的物鏡來獲得較高的橫向解析度時，會導致較小的聚焦深度，為了獲得小聚焦深度下的體積成像，

必須通過一些手段進行Z軸掃描，通過掃描每個焦平面來成像許多平面，這大大限制了成像速度。如果可以犧牲軸向圖像信息，通過擴展焦深在一次橫向掃描中實現體積掃描，也就是體積信息被投影到單個2D圖像中，就可以大大提高成像速度，這被稱為擴展焦深（EDF）成像，對於要求高時間解析度的稀疏群體結構成像（例如神經元活動的功能成像）特別有用。

顯微鏡的軸向和橫向解析度均由物鏡的數值孔徑（NA）決定。高NA可使軸向和橫向解析度以及所收集的光量最大化；較低的NA將產生較低的軸向解析度，即更長的焦深，但同時會犧牲橫向解析度和光收集效率。接下來要介紹的擴展焦深的方法，能夠在保持高橫向解析度和足夠通光量的同時實現擴展焦深。

使用空間光調製器產生焦點細長的貝塞爾光束可以實現EDF成像，但空間光調製器體積大，很難與狹窄的顯微鏡空間兼容；相比之下，基於軸稜錐的貝塞爾模塊便宜且緊湊，但它只能產生固定深度的焦點，不適合用於需要焦深連續變化的各種實驗。為了解決這個問題，2018年，RONGWEN LU等人展示了一種基於軸稜錐的貝塞爾模塊，只需要在該模塊中沿光軸平移一個透鏡，就可以連續調節貝塞爾焦點的軸向長度。

圖1（a）貝塞爾模塊裝置圖；（b）當D分別為－12mm，0mm和12mm時實驗測得點擴散函數；（c）橫向半高全寬、（d）軸向半高全寬、（e）峰值信號和（f）物鏡後光功率隨L2位移D的變化關係

形成長度可變的貝塞爾焦點的模塊裝置如圖1a所示，入射的高斯光束經過軸稜錐和透鏡L1之後被整形為環形光束，緊接著的環形光圈掩模可以阻擋由軸稜錐缺陷引起的雜散光，從而塑造雙光子激發點擴散函數的軸向分布。之後光束被透鏡L2和L3投射到振鏡上，再通過透鏡L4和L5到達物鏡的後焦面。

這些設計與傳統的基於軸稜錐的模塊類似，不同之處在於通過沿光軸移動L2或L3，可以連續調節貝塞爾焦點的軸向長度。圖1b顯示了D分別為－12mm，0mm和12mm時的軸向點擴散函數，其軸向半高全寬分別為39?m，24?m和14?m。如圖1c－f，從左至右移動透鏡L2可以連續改變橫向和軸向的半高全寬，也就是可以連續改變焦深，且基於矢量衍射理論的數值模擬結果與實驗數據非常吻合。圖2驗證了不同尺寸的環形掩模對軸稜錐缺陷的校正作用，發現較薄的環形掩模能夠更好地優化輸出貝塞爾光束的軸向強度分布，但同時也會導致更多的功率損耗。

圖2不同環形掩模得到輸出焦點的軸向強度分布。無掩模（紅色實線）；掩模1（藍色實線）；掩模2（黑色實線）；模擬結果（黑色虛線）

圖3 a，b：使用高斯光束的體成像結果；c－j：使用貝塞爾光束不同D值時的成像結果

該組分別使用高斯光束和貝塞爾光束對斑馬魚中腦和後腦的脊柱神經元進行成像（圖3），發現即使使用最短的貝賽爾焦點也能比使用高斯光束掃描更多的神經元，並且可以提供和二維高斯掃描方式相當的橫向解析度。最後，該組對斑馬魚幼蟲脊髓投射神經元進行體積鈣成像（圖4），研究了參與逃避行為的斑馬魚的神經元動態過程，採用體積速率為50 Hz的貝塞爾光束監測這些神經元的活性，鑑定出其中的15個神經元，這些神經元表現出敲擊誘發的鈣瞬變。與高斯光束相比，使用貝塞爾光束時體積速率提高了26倍。

圖4斑馬魚幼蟲脊髓投射神經元體區域的50 Hz鈣成像

除了以上提到的使用空間光調製器和軸稜錐來獲得貝塞爾光束的方法外，早年最簡單的方式是使用環形狹縫和傅立葉變換透鏡，透鏡會對經過環縫的光場作傅立葉變化，在其後焦面處產生近似貝塞爾光束，但是使用一個簡單的環形孔擴展焦深會導致光的大量損失，只有一小部分可用的光會通過環面傳輸，會影響成像。

為了解決使用單個環擴展焦深光通量不夠的問題， BINGYING CHEN等人利用超短脈衝相干長度短的特性，採用多環結構的分束掩模，超快雷射脈衝經過時會被分束掩模分成不同的環形子束，每個子束都有時間延遲，也就是每個子束在不同的時間點在物鏡的焦平面上形成貝塞爾焦點。如果每個環引入的時間延遲大大超過了雷射脈衝的持續時間，則子束將互不相干，產生的EDF焦點是所有單個貝塞爾焦點的非相干疊加，如圖5所示。

圖5 a：分束掩模結構圖；b：分束掩模擴展焦點深度的原理示意圖；c：模擬的不同環形光非相干疊加的結果（1－5表示由內到外，EDF：深度擴展後的焦點）

基於實驗設計的掩模參數，該組進行了數值模擬，結果如圖6，最大NA為0．67時計算得到的橫向和軸向解析度分別為550nm和15．98μm，比常規聚焦方式的軸向尺寸大4．96倍，而橫向半高全寬僅比常規聚焦方式大7％。

圖6 點擴散函數的數值模擬結果

該組搭建的實驗裝置如圖7所示，由鈦寶石雷射器輸出的中心波長900nm，脈衝寬度140fs的超短脈衝通過普克爾盒進行功率調節，經過擴束器後進入掩模，掩模每層的厚度約為400μm，對脈衝提供的時間延遲為720fs，滿足非相干疊加的要求。之後光束經過一系列透鏡和兩個振鏡被耦合至物鏡光瞳平面，實現擴展焦深成像。

圖7 實驗裝置圖。1：普克爾盒，光隔離器；2，4，7，8，18：透鏡；3：圓孔；5：虹膜；6：分束掩模；9，12：振鏡；10，11：普羅素目鏡；13：掃描透鏡；14：管狀透鏡；15：二向色鏡；16：物鏡；17：濾波器；19：光電倍增管

對輸出光束的點擴散函數測量結果如圖8所示。對比有掩模和無掩模的點擴散函數發現，有掩模時的軸向半高全寬是無掩模情況下的5．8倍，橫向半高全寬增加15％。降低無掩模條件的NA使得軸向半高全寬和有掩模時一致，橫向半高全寬增加約1倍。上述結果說明該掩模能在略微犧牲橫向解析度的條件下顯著提升焦點深度。為了驗證分束掩模在神經科學成像中的應用潛力，該組還展示了固定小鼠腦樣本中GFP標記的神經元的螢光成像。

圖8 點擴散函數測量結果。

總之，對於稀疏群體結構，採用上述擴展焦深成像的方法，可以在保持橫向解析度和光通量的同時擴展焦深，進而大大提高成像速度，這在活體神經元信號探測方面十分有潛力。

參考文獻：

［1］ Rongwen L ， Masashi T ， Minoru K ， et al． 50 Hz volumetric functional imaging with continuously adjustable depth of focus［J］． Biomedical Optics Express， 2018， 9（4）：1964－．［2］ Chen B ， Chakraborty T ， Daetwyler S ， et al． Extended depth of focus multiphoton microscopy via incoherent pulse splitting［J］． Biomedical Optics Express， 2020， 11（7）．