「工欲善其事,必先利其器」,能否做一塊好的瓊脂糖凝膠,直接影響到後面的電泳和結果的分析。跑電泳的時候,會出現各種各樣奇怪的圖,展示一下:
從上圖上看,條帶遇到阻礙而發生了扭曲;下圖中亮帶雖沒有發生扭曲,但是卻出現了雜斑。這是因為在制膠時帶入了雜質,形成了障礙物,使得條帶電泳時受到阻礙無法繼續電泳,從而形成扭曲(如上圖);或是制膠時溶膠不完全以致瓊脂糖顆粒殘留,形成一些濃度較高的區域,在DNA電泳經過這些區域時,部分DNA被阻礙在這裡而形成不規則亮帶(如下圖)。
建議在制膠時注意以下幾點:
1. 在制膠時必須將制膠模具、梳子等物品洗淨,以免幹膠及其他雜質帶入;
2. 在溶膠時應觀察溶液中是否有未溶解的瓊脂糖顆粒,確保溶膠完全;
3. 在溶液倒入模具前充分混勻,以免制出來的膠出現不均勻的現象。
除了以上問題,還有一個容易忽略的問題,那就是凝膠的濃度。比如:
以上這兩幅圖是用相同的DNA Ladder、上樣量、電泳電壓並且跑了一樣長的時間,為啥差別明顯?就是由於採用了不同濃度的凝膠電泳而導致的。長片段的DNA選用低濃度的凝膠電泳,短片段的DNA則選用高濃度的凝膠電泳
DNA上樣量的也會影響電泳效果。
上圖是同一基因組DNA,下圖是同一質粒DNA,但是因為不同的上樣量,導致了不一樣的電泳效果。要想電泳跑出條帶的話,至少需要上樣50ng,但是0.5 cm寬的梳子最好不超過0.5μg的DNA量,因為上樣量過多會造成加樣孔超載,從而導致拖尾或彌散,對於較長的DNA此現象更為明顯。當然加樣量的多少還應依據加樣孔的大小及DNA片段的長度而定,加樣孔大時上樣量應相應加大。
兩圖同一樣本跑出的圖,但是出來的效果差別非常大,主要是因為電泳時的電壓不同。上圖由於電泳的電壓過大,導致電泳條帶都扭曲變形了。通常情況下電壓越低,走出的電泳條帶越平整。低電壓電泳時,電泳緩衝液也不容易發燙,也能確保在電泳的過程中凝膠不會變形。當然電壓太低,等待電泳結果的時間就會延長,一般控制電泳電壓≤5V/cm,可保證電泳條帶的清晰度。
這兩幅圖是同一塊凝膠在電泳的不同時間段拍攝的電泳圖。有沒有覺得下圖的電泳條帶還行呢,有主帶,雖然有彌散、拖尾條帶,但是主帶還是很亮的。如果只是看有沒有核酸的話,差不多矇混過去了,但是如果你是想看DNA狀態或者是分離不同長度片段的DNA,那麼必須多跑一會兒,這樣就有了下圖。
這是因為上圖電泳的時間短,不同長度的DNA條帶還未分離,所以只能看見DNA含量最高的主帶;而下圖的電泳時間較長,不同長度的DNA條帶已經分離,可以清晰看到不同長度片段的DNA條帶,甚至兩最下方的兩條RNA條帶都被分離開了。