Western Blot詳解-主要試劑

2020-12-06 生物谷

主要試劑
1、 丙烯醯胺和N，N』-亞甲雙丙烯醯胺，應以溫熱(以利於溶解雙丙稀醯胺)的去離子水配製含有29%(w/v)丙稀醯胺和1%(w/v)N，N』-亞甲雙丙烯醯胺儲存液丙稀醯胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀醯胺1g，加H2O至100ml。)儲於棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或鹼催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配製。如有沉澱，可以過濾。
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配製，室溫保存。
3、 分離膠緩衝液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。

4、 濃縮膠緩衝液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶於40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。這兩種緩衝液必須使用Tris鹼製備，再用HCL調節PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N』N』四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀醯胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀醯胺聚合所必須的自由基。去離子水配製數ml，臨用前配製.
6、 SDS-PAGE加樣緩衝液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩衝液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻後再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸電泳緩衝液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩衝液。臨用前稀釋10倍。
8、 轉移緩衝液：配製1L轉移緩衝液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris鹼、0.37g SDS，並加入200ml甲醇，加水至總量1L。
9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用後應予以廢棄。
10、 脫脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。
12、 Tris緩衝鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 過氧化物酶標記的第二抗體。
15、 NBT(溶於70%二甲基甲醯胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶於100%二甲基甲醯胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。

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