Nature子刊:利用CRISPR/Cas9清除人T細胞基因組中的HIV-1

2016年3月23日/生物谷BIOON/--人免疫缺陷病毒（HIV）導致獲得性免疫缺陷症候群（AIDS），即愛滋病。在一項新的研究中，來自美國天普大學路易斯-卡茨醫學院（Lewis Katz School of Medicine at Temple University）的研究人員開發出一種特定的基因編輯系統CRISPR/Cas9，從而為最終治癒HIV感染鋪平道路。他們證實利用這種基因編輯系統能夠有效地和安全地將這種病毒從在體外培養的人T細胞的DNA中清理掉。相關研究結果於2016年3月4日在線發表在自然出版集團旗下的

Scientific Reports

期刊上，論文標題為「Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing」。

論文共同通信作者、天普大學路易斯-卡茨醫學院綜合NeuroAIDS中心主任、神經病毒學中心主任、神經科學系主任和教授Kamel Khalili博士說，「抗逆轉錄病毒藥物非常善於控制HIV感染。但是接受抗逆轉病毒藥物治療的病人一旦停止服用藥物，就會遭遇到HIV複製快速反彈。」大量HIV拷貝的存在削弱免疫系統，最終導致AIDS。

治癒HIV/AIDS---自從上個世紀八十年代首次發現HIV以來，它已奪去了2500萬多人的生命---是HIV研究的最終目標。但是一旦它整合進CD4+ T細胞---HIV感染的主要細胞---的基因組後，清除這種病毒已被證明非常困難。近期的努力有意專注於重新激活HIV以便觸發強勁的免疫反應從而能夠從被感染的細胞中根除這種病毒。然而，在此之前，這些「激活並殺死（shock and kill）」方法中沒有一種獲得成功。

Khalili博士和同事們決定嘗試著一種不同的方法：利用一種獨特的定製基因編輯系統CRISPR/Cas9特異性地靶向HIV-1前病毒DNA（整合到宿主細胞DNA中的病毒基因組）。他們的系統包括一種特異性地靶向T細胞基因組中HIV-1 DNA的嚮導RNA（gRNA），和一種切割T細胞DNA鏈的核酸酶Cas9。一旦Cas9在基因編輯過程中刪除HIV-1 DNA序列，那麼T細胞基因組的鬆散末端被該細胞自身的DNA修復機制重新連接在一起。

在之前的研究中，Khalili博士的研究團隊已證實他們的基因編輯系統CRISPR/Cas9能夠從人細胞系中切除HIV-1 DNA。然而，在這項新的研究中，他們著重研究HIV潛伏地和有效地感染的人CD4+ T細胞，並證實這種技術不僅將這種病毒從T細胞中清除，而且在HIV-1已被根除的T細胞中，這種系統的持續存在阻止它們再次感染。更為重要的是，他們在體外開展實驗，先將來自HIV感染者的T細胞在體外進行培養，隨後證實利用這種基因編輯系統處理這些T細胞能夠抑制病毒複製和顯著地降低病人T細胞中的病毒載量。

在這項研究的另一個重要組成部分中，Khalili博士的研究團隊解決了關於脫靶效應和毒性的問題。利用一種被稱作超深全基因組測序的方法，它也被認為是評估基因組的金標準，研究人員分析了HIV-1已被根除的T細胞的基因組，以便確定gRNA靶向的基因組區域以外的基因是否發生突變。他們的分析結果排除了基因發生脫靶效應，包括對T細胞基因表達的間接影響。對T細胞活力和增殖的研究證實HIV-1已被根除的T細胞正常地生長和發揮功能。

Khalili博士說，「這些發現的重要性體現在多個層次上。它們證實我們的基因編輯系統能夠將HIV從CD4+ T細胞DNA中有效地清除掉，而且通過讓HIV-1基因組發生突變，從而永久性地讓它不能複製。再者，它們證實這種系統能夠讓T細胞免受再次感染，而且這種技術對T細胞是安全的，沒有毒性作用。」

他補充道，「在此之前，人們從未在這種程度上開展這些實驗。但是[我們開展的這些實驗]解決的問題是比較關鍵的，而且這些結果允許我們利用這種技術繼續取得進展。」（生物谷 Bioon.com）

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Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing

doi:10.1038/srep22555

Rafal Kaminski, Yilan Chen, Tracy Fischer, Ellen Tedaldi, Alessandro Napoli, Yonggang Zhang, Jonathan Karn, Wenhui Hu & Kamel Khalili

We employed an RNA-guided CRISPR/Cas9 DNA editing system to precisely remove the entire HIV-1 genome spanning between 5′ and 3′ LTRs of integrated HIV-1 proviral DNA copies from latently infected human CD4+ T-cells. Comprehensive assessment of whole-genome sequencing of HIV-1 eradicated cells ruled out any off-target effects by our CRISPR/Cas9 technology that might compromise the integrity of the host genome and further showed no effect on several cell health indices including viability, cell cycle and apoptosis. Persistent co-expression of Cas9 and the specific targeting guide RNAs in HIV-1-eradicated T-cells protected them against new infection by HIV-1. Lentivirus-delivered CRISPR/Cas9 significantly diminished HIV-1 replication in infected primary CD4+ T-cell cultures and drastically reduced viral load in ex vivo culture of CD4+ T-cells obtained from HIV-1 infected patients. Thus, gene editing using CRISPR/Cas9 may provide a new therapeutic path for eliminating HIV-1 DNA from CD4+ T-cells and potentially serve as a novel and effective platform toward curing AIDS.