免疫治療丨免疫檢查點抑制劑生物標誌物之HLA

隨著腫瘤免疫治療時代的到來，免疫檢查點抑制劑的研發和審批的進步，確保了免疫檢查點抑制劑已經作為腫瘤治療的新的有效方法之一。臨床研究顯示，單獨使用PD-1抑制劑，只有20-40%的病人會對免疫治療產生反應，醫生很難知道免疫療法是否對某個病人有效，如何篩選出這部分有應答的患者則是臨床所面臨及需要解決的問題 。（經典型霍奇金淋巴瘤是一個例外，單獨使用，有效率高達80%以上）

有沒有生物標誌物（Biomarker）能夠預測對免疫檢查點抑制劑的反應？開發生物標誌物對於幫助患者分層以及預估患者是否對免疫阻斷單獨療法有反應，是否需要組合療法或者接受其他的治療是必要的。

精準醫學始於靶向治療，免疫治療從一開始就在思考能否利用靶向治療開闢新的成功路徑。就目前而言，免疫治療已經開闢了通向精準治療的各種路徑。

目前，影響 Immune checkpoint inhibitor（免疫檢查點抑制劑）的有效生物標誌物包括：PD-L1，MSI，dMMR，TMB，Neoantigen等，更多反映免疫療效的生物標誌物還在不斷的研究與試驗中。

今天我們聊聊HLA（Human Leukocyte Antigen，人類白細胞抗原），HLA又稱為MHC（Major Histocompatibility Complex，主要組織相容性複合物），是存在於抗原呈遞細胞表面負責抗原呈遞的蛋白分子。上篇免疫治療文章我們說到過新生抗原，新生抗原為什麼可以預測免疫檢查點抑制劑的療效？那是因為它與HLA-1（MHC-1）結合後可以被呈遞至細胞表面並將其傳遞給CD8+的T細胞，才能夠激活CD8+細胞，進而殺傷腫瘤細胞。所以，免疫檢查點抑制劑的治療中，抗原呈遞能力才是關鍵！

HLA背景介紹

HLA，通常稱之為MHC分子或主要組織相容性複合物，位於人類6號染色體短臂6p21.3上長度約4.0M的區域內，包含超過200個基因。除同卵雙生子以外幾乎找不到HLA相同者，每個人的HLA千差萬別，因此，HLA有人體生物學「身份證」之稱。它是不同個體免疫細胞相互識別的標誌，機體「區分敵我、識別自身、排除異已」的主要遺傳標記，參與免疫應答反應，具有非常重要的生物學功能。

MHC基因產物在不同細胞表面表達，對抗原遞呈和免疫信號傳遞起關鍵作用。HLA主要包括HLA-I類、HLA-II類和HLA-III類三個區，因序列上高度可變，導致HLA等位基因數量異常龐大。

HLA-I類基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C等，分布於幾乎所有有核細胞表面，以淋巴細胞表面密度最大。HLA-II類基因包括HLA-D家族，主要有HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR等，主要分布於B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等專職抗原提呈細胞表面。HLA-III類基因大約包含75個基因，大多數功能不明。

HLA-I類（MHC I）和II類（MHC II）基因是編碼結合和呈遞抗原的分子，使細胞毒性T淋巴細胞經抗原結合槽與成熟的HLA細胞表面蛋白結合，I類基因主要將抗原呈遞給CD8+ T細胞，II類基因主要將抗原呈遞給CD4+ T細胞。

T細胞受體（TCR）在識別APC細胞或者靶細胞上的MHC分子所提呈的抗原肽時，不僅識別抗原肽，還要識別與抗原肽結合的MHC分子類型。

HLA-I是細胞膜糖蛋白，由一條（重鏈）α鏈和一條（輕鏈）β2微球蛋白組成，重鏈分為胞漿區，跨膜區，胞外活性區（免疫球蛋白樣區，肽結合區）。HLA-II是膜糖蛋白，由一條α多肽鏈和一條β多肽鏈組成。

HLA複合物是整個人類基因組中最多態性的區域，截至2018.05.05日，相關資料庫（Release 3.32.0）顯示有近18,181種不同的HLA等位基因。隨著越來越多的新等位基因出現，該HLA等位基因名單將繼續迅速擴大。每種HLA等位基因可表現出對同一新生抗原不同的親和呈遞能力，這也是目前流行的新生抗原預測的核心所在。詳情參考：IPD-IMGT/HLA資料庫：https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html

IPD-IMGT/HLA資料庫是一個專門提供人類主要組織相容性複合體(MHC),包括WHO序列命名法委員會命名的HLA系統等位基因信息。IPD-IMGT/HLA資料庫是國際免疫遺傳學項目(IMGT)的一部分。

HLA的命名

按照世界衛生組織HLA系統命名委員會2010年公布的等位基因命名原則，一個完整的HLA等位基因由8個數字和1個字母組成（Subtype也可能3位）。

比如上圖的HLA-A* 24:02:01:02 L，其中「A」代表基因座位，「24」代表對應的血清學特異性，「02」代表編碼區鹼基取代並且胺基酸改變，「01」代表編碼區鹼基取代但胺基酸不變，第二個「02」代表內含子或非編碼區鹼基取代，最後的字母表示基因的蛋白表達狀態（「L」代表該等位基因低表達，「N」表示該等位基因不表達，「S」表示該基因編碼可溶性的分泌型蛋白，「C」表示該等位基因編碼的產物存在於胞漿中，「A」表示異常表達的等位基因，「Q」表示有疑問而不能斷定）。

備註：G組是由WHO HLA命名委員會確定和命名。G表示具有相同的第2、3外顯子序列的一組HLA-I類等位基因或具有相同第2外顯子序列的一組II類等位基因：如DRB1*12:01:01G包括了DRB1*12:01、DRB1*12:10。

HLA與免疫治療

與腫瘤免疫檢查點抑制劑相關的HLA類型主要是HLA-I類基因，CD8+ T細胞只有識別HLA I類分子呈遞出來的短肽，才能夠被激活。HLA I類分子主要包括HLA-A，HLA-B，HLA-C三類。

新生抗原那篇文章我們有說到腫瘤新生抗原的預測流程，新生抗原預測流程中最重要也是最核心的一部分就是確定HLA I類基因的亞型（HLA-A/HLA-B/HLA-C三類，解析度達到中高解析度就可以），然後通過軟體預測突變多肽與HLA的親和力（常看IC50值，代表與50%的等位基因所編碼的HLA蛋白結合時的肽段濃度，單位為nM，一般≤500nM；Rank（%），親和力相對百分排位，≤2%）。

今天這篇文章我們不說新抗原，直接說通過HLA的基因分型便可以預測免疫治療的效果及預後，也就是HLA也可以單獨作為一個Biomarker來預測免疫治療的效果，而不需要預測新生抗原與HLA的親和力。

下面我們看看HLA與免疫治療之間到底有什麼關係：

一、HLA等位基因的抗原呈遞能力可能天生就有差別：

MSKCC的研究人員對1535名接受免疫檢查點抑制劑治療的晚期癌症患者HLA-I 基因型進行了研究。研究人員將受ICB治療的癌症患者分成了兩組，第1組為接受CTLA-4抗體或PD-1抗體治療的369例晚期黑色素瘤或晚期非小細胞肺癌患者，第2組為接受CTLA-4抗體、PD-1或PD-L1抗體單藥治療或聯合治療的1166例泛癌種患者，其中包括黑色素瘤和非小細胞肺癌。

研究結果顯示，與純合子的患者相比，在HLA-I 位點（A/B/C）高度雜合可提高ICB治療後的總體生存率（一個個體理論上可以產生6種不同的HLA-I（HLA-A/B/C），因為人是二倍體，一條來自父親，一條來自母親，所以就是3X2=6個點；如果再加DQ/DP兩個基因，那麼就是5X2=10個點）。

在兩組獨立的黑素瘤患者中，HLA-B44超型等位基因的患者延長了總生存期（HLA-B44超型的等位基因很可能本身具有強的抗原呈遞能力，從而更容易在免疫治療中獲益），而HLA-B62超型等位基因（包含HLA-B*15:01）或HLA-I的體細胞雜合性缺失（somatic LOH）患者預後差。HLA-B*15:01分子動力學模擬揭示了可能損傷新抗原CD8+T細胞識別的獨特元素。

這些超型結合受到HLA-I等位基因特定成分的影響：HLA-B44受到HLA-B*18:01，HLA-B*44:02，HLA-B*44C:03，HLA-B*44:05和HLA-B*50:01的影響；HLA-B62主要由HLA-B*15:01驅動。

值得注意的是，HLA-B44等位基因與癌症基因組圖譜（TCGA）中黑色素瘤患者的生存沒有關係，這表明HLA-B44的存在是對ICB的預測反應，並不是預後。

研究人員還發現， 單一位點HLA-I基因（A/B/C）純合性與生存率降低的有顯著關聯：HLA-A (P = 0.003,HR = 1.38,95% CI 1.11 - 1.70)，HLA-B (P = 0.052,HR = 1.66,95% CI 0.93 - 2.94)，HLA-C (P = 0.004,HR = 1.60,95% CI 1.16 - 2.21)。

二、HLA體細胞突變與免疫逃逸之間的關係

加州大學聖地牙哥分校Joan Font-Burgada教授團隊分析了TCGA中10種腫瘤類型共9176個腫瘤患者的體細胞突變與HLA的關係。

作者巧妙的設計了Patient Harmonic Best Rank （PHBR）參數將各體細胞突變產生的長度為8~11突變肽段與3種HLA-I型等位基因（至多共6個HLA-A/B/C）的多個親和力合併為患者HLA對該突變的整體抗原呈遞水平。突變對應的PHBR越高（HLA與突變肽的親和力越弱），說明患者的HLA對該突變抗原呈遞能力越差。

TCGA腫瘤患者中的群體突變頻率越高，則該突變所產生的突變肽被HLA抗原呈遞能力越弱。可能原因為：腫瘤進化的過程中，攜帶被HLA高抗原呈遞的突變腫瘤克隆在早期免疫監視中已經被免疫細胞識別殺傷而大量清除掉。只有那些攜帶被HLA抗原呈遞弱的突變腫瘤克隆才能更容易逃脫機體的免疫監視，從而在腫瘤形成後表現出高的群體突變頻率。

此外，在10種研究的腫瘤類型中，攜帶了HLA體細胞突變的患者相比HLA野生型的患者有著顯著高的TMB。這可能意味著HLA識別新生抗原介導的免疫監視功能的削弱，使得攜帶突變的腫瘤克隆易於免疫逃逸，在宏觀上表現出高TMB。（HLA體細胞變異可能不會獲益於免疫治療）