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TGFβ2 is a prognostic-related biomarker and correlated with immune infiltrates in gastric cancer
TGFβ2表達水平、生物標誌物和免疫浸潤與胃癌患者預後的關係
就在剛剛還有同學問我「可不可以開展零代碼生信文章的復現呀？感覺生信的文章看著都挺簡單，可是一動手卻困難重重…」
為此我們趕緊特意安排了幾篇文章來分享給大家
其實前段時間小編已經給大家分享了單基因泛癌分析，拿著自己研究的基因，通過Sangger box雲平臺就可以得到了屬於自己的單基因分析報告（如果有興趣的話可以去翻一下那篇文章）
強調：代碼編程和網頁小工具只是數據分析方法，重要是研究思路，如何將分析結果將生物學含義聯繫起來才是至關重要的點。
下面這篇文章的分析內容比小夥伴們拿到的那份分析報告內容少了很多，但是文章分數卻不低，文章的題目雖然是關於胃癌的，但是作者研究的研究思路卻是泛癌，值得小夥伴們借鑑。一起來看看吧！
流程圖
研究背景
在所有的癌症中，胃癌（GC）是最致命的癌症之一，這種現象在東亞尤為普遍。胃癌患者由於腫瘤容易發生轉移導致患者預後很差。研究發現，免疫分子可以調節GC的發展和進程，因此，有許多不同的免疫療法可以作為治療胃癌的手段。
TGF-β是一種細胞因子與惡性腫瘤進展密切相關，其基因家族具有三個成員，TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β1和TGF-β2通過影響基質細胞和腫瘤細胞的活性，以調節腫瘤進展。TGF-β信號傳導可以誘導強烈的免疫抑制，在腫瘤微環境中的，通常由腫瘤細胞和免疫細胞分泌。TGF-β是腫瘤微環境的有效調節劑，因為它可以調節腫瘤細胞，免疫細胞和基質細胞之間的相互作用，同時調節細胞因子的產生。外周血單個核細胞（PBMC）是能夠分泌細胞因子的關鍵免疫細胞，當它們與癌細胞相互作用時，它可以誘導或損害腫瘤特異性免疫反應，從而確定腫瘤是否經歷了凋亡性死亡或能夠發展為惡性腫瘤。
作者使用包括Oncomine，PrognoScan和Kaplan-Meier在內的公共資料庫對TGFβ2與患者預後之間的關係進行系統的分析並且使用腫瘤免疫細胞評分網頁工具（TIMER）進一步研究了TGFβ2表達水平與腫瘤免疫細胞浸潤之間的關係。
材料和方法
1. Oncomine資料庫分析
Oncomine資料庫是將86733個樣本和715個基因表達譜數據整合在一起的綜合資料庫，目的是便利與世界各地的研究者進行數據挖掘工作。因此，作者使用該資料庫分析了各種腫瘤類型中TGFβ2表達與預後之間的關係。
2. PrognoScan資料庫分析
PrognoScan資料庫整合了大量帶有預後信息的晶片數據集，可以用來分析基因與患者預後的關係。因此，作者使用這個資料庫來評估TGFβ2表達情況與患者預後之間的關係。
3. Kaplan-Meier曲線分析
使用Kaplan-Meier曲線展示21種不同類型癌症患者生存情況與基因表達的關係，利用kmplot資料庫來分析胃癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌患者TGFβ2表達情況與預後的關係，分析臨床病理因素和TGFβ2對胃癌患者預後的影響。
4. TIMER資料庫免疫評分分析
TIMER資料庫分析多種癌症中免疫細胞評分的資料庫，作者TIMER資料庫評估特定腫瘤類型中TGFβ2表達水平的差異，然後分析了TGFβ2的表達水平與免疫細胞亞群的浸潤程度之間的關係。進一步進行了Kaplan-Meier曲線分析，以探討患者生存率的差異與基因表達或免疫細胞浸潤的關係。
5. GEPIA資料庫分析
GEPIA是一個在線資料庫，它整合了TCGA數據和GTEx數據集中9736個腫瘤樣本和8587個正常對照樣本的RNA-seq數據。作者使用該資料庫來驗證多種腫瘤類型中TGFβ2表達與患者預後之間的關係，並進一步驗證TGFβ2表達與腫瘤免疫細胞浸潤相關的生物標記物關係。
6. 統計分析
使用log-rank檢驗是否存在差異顯著性，使用Spearman's 相關分析來計算變量之間的相關性。
主要結果
1. 不同癌種中癌症組織和正常組織TGFβ2表達的差異性分析
首先使用Oncomine資料庫分析了多種腫瘤組織與正常組織的表達情況，結果顯示，與其他癌種相比，基因TGFβ2在腦癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、直腸癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、腎癌和胰腺癌中的表達水平較高，與正常組織相比在腦組織、乳腺、腎、肺癌和前列腺癌組織表達量較低（圖1A）。作者進一步使用TCGA和TIMER資料庫評估TGFβ2在特定腫瘤類型中的表達差異，結果顯示，在膽管癌（CHOL）、結腸腺癌（COAD）、肝細胞癌（LIHC）、胃腺癌（STAD）和甲狀腺癌（THCA）中TGFβ2的表達量顯著高於正常對照組，而在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺浸潤癌（BRCA）、腎嫌色細胞增多症（KICH）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、腎透明細胞癌（KIRC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）和子宮體子宮內膜癌（UCEC）中TGFβ2的表達量顯著低於正常對照組（圖1B）。
圖1 TGFβ2不同類型腫瘤組織和正常組織中的表達水平
2.TGFβ2表達水平與泛癌患者預後或復發的關係
使用PrognoScan資料庫分析TGFβ2的表達水平與癌症患者預後之間的關係，結果顯示；多種癌症類型的患者預後和TGFβ2表達水平之間存在顯著相關性，包括乳腺癌、肺癌、血液癌、卵巢癌、前列腺癌、腦癌和結腸癌（圖2A-H）。進一步使用Kaplan-Meier資料庫展示TGFβ2的表達水平與各種癌症類型預後之間的關係，結果表明:TGFβ2表達量升高胃癌患者（OS HR=1.62，95%CI(1.35-1.98)，P=1.97e-7；PFS HR=1.82，95%CI(1.48-2.24)，P=7.6e-9）和卵巢癌患者（OS HR=1.18，95%CI(1.04-1.34)，P=0.013；PFS HR=1.35，95%CI(1.18-1.55)，P=1.4e-5）預後較差，且顯著相關（圖2I-L）;TGFβ2表達量降低，肺癌患者（OS HR=0.83，95%CI=0.73-0.94，P=0.0029；PFS HR=0.78，95%CI=0.64-0.94，P=0.01）預後較差，且顯著相關（圖2M-N）而TGFβ2的表達量與乳腺癌患者的預後無明顯關係。因此，通過上述分析可以得出結論，TGFβ2的表達水平與多種類型腫瘤患者的預後差顯著相關。
圖2 TGFβ2表達水平與泛癌患者預後或復發的關係
3.胃癌淋巴結轉移患者中TGFβ2表達水平與預後的關係
接下來，作者進一步使用Kaplan-Meier資料庫來分析TGFβ2表達情況與患者臨床病理之間的關係。結果發現，除Stage I之外，TGFβ2的表達水平與OS、DFS及患者性別、腫瘤分期、T分期、N分期、M分期、Lauren分類和分化顯著相關（表1）。作者進一步發現TGFβ2的表達水平與胃癌患者的淋巴結轉移程度密切相關，淋巴結轉移是胃癌患者最常見的轉移類型，與患者預後直接相關，在胃癌中，TGFβ2表達水平和DFS的關係而言，N期的HR最高（HR=4.22（1.56-11.44，P=0.0020），這表明TGFβ2的表達可能通過影響胃癌患者的淋巴結轉移而影響胃癌患者的預後。
表1 TGFβ2基因表達水平與胃癌中不同臨床病理因素對患者預後的影響
4.胃癌中TGFβ2表達水平與免疫細胞評分的關係
在癌症患者中，患者的生存率和淋巴結轉移的相關性是通過淋巴細胞浸潤腫瘤的頻率預測的。因此，作者使用TIMER資料庫計算39種腫瘤類型免疫細胞評分與TGFβ2表達水平之間的相關性。作者發現在24種癌種中TGFβ2的表達水平與腫瘤浸潤程度具有顯著相關性，其中，19種癌種與CD8+T細胞免疫評分、21種癌種與D4+T細胞免疫評分、23種癌種與巨噬細胞免疫評分，23種癌種與中性粒細胞免疫評分、23種癌種與樹突狀細胞免疫評分有顯著的相關性。TGFβ2表達水平與間皮瘤（MESO）中B細胞免疫評分、CD4+T細胞免疫評分、CD8+T細胞免疫評分、巨噬細胞免疫評分、中性粒細胞免疫評分無顯著的相關性（圖3A）。與此同時，胃腺癌（STAD）中，TGFβ2的水平與腫瘤純度之間沒有這種關係，但是在同一類型的癌種中，TGFβ2的表達與CD8+T細胞（R=0.139，P=7.24e-03）、CD4+T細胞（R=0.258，P=5.75e-07）、巨噬細胞（R=0.442，P=3.77e-19）、中性粒細胞（R=0.124，P=1.68e-02）和樹突狀細胞（R=0.248，P=1.29e-05）的水平顯著相關（圖3B）。最後，使用Kaplan‐Meier曲線分析免疫細胞評分與MESO和STAD中TGFβ2表達水平之間的關係，作者發現巨噬細胞免疫評分（P=.004）和TGFβ2的表達水平（P<.001）與STAD預後顯著相關（圖3C），而在MESO中患者的預後與免疫細胞評分或TGFβ2表達水平沒有顯著相關（圖3D）。這些表明TGFβ2在胃癌免疫細胞浸潤中起著重要的調節作用，對巨噬細胞浸潤的調節作用特別明顯。
圖3 TGFβ2表達水平與細胞免疫之間的關係
5.TGFΒ2表達水平與免疫標誌物表達水平之間的相關性
利用TIMER和GEPIA資料庫，以MESO為對照組，進一步探討了TGFβ2表達與STAD免疫細胞浸潤水平之間的關係，評估了特定的細胞亞群中TGFβ2表達情況與parkers水平之間的相關性。結果顯示，在STAD中患者中，TGFβ2的表達水平與STAD中大多數單核細胞、TAM、M1和M2巨噬細胞標誌物的表達相關。尤其是，與STAD中的單核細胞標記物（CD86、CD115）、TAM標記物（CCL2、IL10）、M1巨噬細胞標記物（INOS、IRF5、COX2）和M2巨噬細胞標記物（CD163、VSIG4、MS4A4A）顯著相關（P<0.0001；圖4A-H）。
圖4腺癌（STAD）和間皮瘤（MESO）中TGFΒ2表達與免疫學標誌物之間的相關性分析
因此，我們利用GEPIA資料庫進一步分析了STAD中TGFβ2的表達與免疫標記物之間的關係，結果顯示TGFβ2與單核細胞、TAMs、M1和M2巨噬細胞等標記物與TIMER資料庫的標記物之間有相似的相關性（表3）。提示在STAD中，TGFβ2可能具有調節巨噬細胞的作用。TGFβ2的表達升高也與STAD中DC浸潤的增加有關。DC標誌物BDCA-1、BDCA-4和CD11c與TGFβ2的表達相關，這表明TGFβ2與腫瘤DC的浸潤密切相關。
表3 TGFβ2與相關基因的相關性分析
結論
在本研究中，作者Oncomie資料庫和GEPIA資料庫分析了TGFβ2的表達水平與33種不同類型癌症的預後相關性，揭示了許多癌症中TGFβ2在腫瘤組織與正常組織之間表達水平存在明顯差異。這項研究的另一個發現，TGFβ2的表達情況與多種癌症類型，尤其是GC中的免疫浸潤程度相關。例如，TGFβ2表達水平與巨噬細胞浸潤程度呈正相關，而與STAD中CD8 +，CD4 +，DC和中性粒細胞浸潤的程度呈弱正相關。進一步發現巨噬細胞浸潤與GC預後顯著相關。此外，研究還發現到TGFβ2與某些免疫標記基因表達之間有很強的相關性。