Nature Protocol|六倍體小麥基因組編輯系統

2020-08-20 事事聊生信

2014年9月，中科院遺傳所高彩霞團隊在《Nature Protocols》雜誌上發表了題為「Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system」的文章，詳細描述了利用CRISPR/Cas系統實現水稻和小麥基因組編輯的實驗方案。

如今2018年2月1日高彩霞團隊在《Nature Protocols》雜誌又發表了題為「Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts or ribonucleoproteins」的文章，作為小麥基因組編輯的升級版本，可以說將小麥基因組編輯技術進一步向前推進。

文獻摘要

近年來，CRISPR / Cas9已經成為改善作物性狀的有力工具。常規的植物基因組編輯主要依靠通過農桿菌或粒子轟擊讓質粒攜帶進行傳遞後實現編輯。通過粒子轟擊傳遞CRISPR / Cas9的體外轉錄物（IVT）或核糖核蛋白複合物（RNPs）實現麵包小麥的DNA-free的編輯系統。該方法是之前發表的通過粒子轟擊傳遞CRISPR / Cas9質粒的小麥基因組編輯方法的延伸。新的描述的方法不僅消除CRISPR / Cas9隨機整合到基因組DNA中，而且減少了脫靶效應。在這個新的方法中，提供了IVT和RNP的準備的詳細實驗操作步驟，並通過PCR /限制性內切酶（RE）和下一代測序驗證;通過使用新的方法，可以在9-11周內獲得和鑑定不使用任何外來DNA編輯的植物。

CRISPR/Cas9 IVT-或RNP介導的小麥基因組編輯的概述


整個實驗流程包括了CRISPR / Cas9 IVT和RNP的製備，包衣，傳遞，幼苗再生和突變體篩選。首先在原生質體瞬時轉化系統中測定和評估高活性的候選的sgRNA，然後使用sgRNA序列上遊T7啟動子（步驟1-13）對PCR產物進行轉錄。使用經過密碼子優化的、側翼有兩個NLS序列、玉米泛素1基因的5'-和3'-非翻譯區序列及PolyA信號序列的XbaI-linearized pLZT7-zCas9轉錄Cas9 mRNA（步驟14A）。細菌細胞誘導，表達和純化Cas9蛋白質（步驟14B）。預組裝的RNP複合物通過體外切割（步驟15-19）和原生質體瞬時表達分析（步驟20-30）進行驗證。獲得未成熟的胚芽的植物在溫室中需要生長90天，應該提前啟動培養（步驟31）。然後將CRISPR / Cas9 IVT或RNP傳遞到收穫的未成熟胚芽中（步驟32-37），並通過NGS確認傳遞（步驟38-46;圖2）。在整個組織培養過程中不使用抗生素。2周後誘導產生胚性愈傷組織（步驟47），4-6周後完成再生（步驟48-50）。首先通過PCR / RE利用保守的引物同時識別庫中三種不同類型的突變體幼苗（步驟51-57）。藍色的表示代表性的突變體。給出陽性信號的幼苗通過PCR / RE和用homolog-specific primer 擴增後測序（步驟58-61）。 NHEJ引入的突變可導致未分離的條帶，以藍色表示。He：雜合突變體;Ho:純合突變體; WT/D，用限制性內切酶消化的野生型擴增產物; WT/U，野生型擴增產物沒有被消化。

參考文獻

Shan, Q., Wang, Y., Li, J., & Gao, C. (2014). Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system. Nature protocols, 9(10), 2395.

Zhen Liang et al. (2018). Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts or ribonucleoproteins. Nature protocols

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