岡崎令治與DNA的半不連續複製

2020-12-06 李老師談生化

#DNA複製#梅塞爾森和凱恩斯等人證實了DNA的半保留複製機制。但是,關於DNA鏈延伸的具體機制,還存在一個「延伸方向悖論」,即所有DNA聚合酶均以5』-3』方向合成,而實驗觀察中兩條反向平行的DNA鏈又都是連續延伸的。也就是說,下面的兩個模型都缺乏實驗支持。

DNA鏈延伸的兩種模型。Proc Jpn Acad S

解決這個問題的是名古屋大學的岡崎夫婦,岡崎令治(Reiji Okazaki)和岡崎恆子(Tsuneko Okazaki)。他們曾在科恩伯格實驗室學習,回國後將複製方向問題作為自己的研究主題。岡崎認為,DNA複製過程中可能形成了很多較短的DNA片段,但用宏觀方法難以分辨。比如放射自顯影的每個顆粒對應的核酸片段其實大於1000個核苷酸,難以發現不連續的小片段。所以必須建立微觀的、核苷酸水平的實驗體系。

他們用放射性元素氚標記胸苷,在很短的時間內進行複製,以控制其僅在DNA鏈的末端摻入少數幾個放射性核苷酸,即脈衝標記。經過計算,如果在37℃下合成,時間必須小於0.1秒才行,顯然無法達成。所以他們採用了低溫脈衝合成方法,在低溫(20℃或更低)條件下將細菌暴露於氚標記的胸苷數秒,終於發現了長度為僅1,000-2,000個核苷酸的DNA片段(後來稱為岡崎片段)。

當脈衝標記時間延長,放射性會從短的DNA片段轉移到較長的DNA鏈。而對DNA連接酶的抑制會導致岡崎片段的積累。這些發現提示了DNA的不連續複製機制。1968年,岡崎令治應邀參加冷泉港研討會,提出了DNA的不連續複製模型。

岡崎夫婦還發現岡崎片段合成需要RNA引物,以及前導鏈的連續複製等。可惜的是,岡崎令治在廣島讀高中時遭遇原子彈輻射,1975年死於白血病,享年44歲。之後恆子繼續研究,最終建立了半不連續複製(semi-discontinuous replication)模型。

在模型中,一條子代DNA鏈與複製叉同向,由5』向3』方向連續複製,稱為前導鏈(leading strand);另一條鏈的延伸方向與複製叉相反,形成許多不連續的岡崎片段(Okazaki fragment),最後由DNA連接酶拼接成完整的DNA,稱為滯後鏈(lagging strand)。

岡崎的半不連續複製模型。Proc Jpn Aca

圖中模板DNA上的點表示引物RNA合成的起始信號序列。他們鑑定了模板DNA上的引物合成信號序列,並繪製在圖中。結果表明,引物信號多於岡崎片段數。這說明在複製時可以選擇不同的信號序列,具有一定的靈活性,也有助於複製不留空隙。

從半不連續模型上看,似乎前導鏈和滯後鏈是由兩個酶分別合成,前進方向相反。但其實它們是由一個雙核心的pol III複合物催化的,兩條鏈前進的方向是相同的。這是布魯斯·阿爾伯茨(Bruce Alberts)提出的 「長號」 DNA循環模型(Trombonemodel)。

滯後鏈合成的長號模型。Mol Cell. 2006

模型中,滯後鏈解鏈後的ssDNA回折,形成一段DNA環。回折後的滯後鏈即可與前導鏈同時被pol III的兩個核心分別催化。滯後鏈的延伸使DNA環不斷伸長。當這個岡崎片段合成完畢,核心酶會轉移到新的RNA引物處,合成下一個岡崎片段,DNA環又變短。這樣,DNA環周期性伸縮,恰似長號演奏的情景。

長號,引自百度圖片

大腸桿菌複製叉移動速度約為每秒1 kb,岡崎片段長度為1-2 kb ,因此這個長號的伸縮周期只有幾秒鐘,催化滯後鏈的核心酶也需要不斷轉移。引發酶(DnaG)合成新的引物後,被鉗加載器(clamp loader)識別,並在雜合雙鏈處加載新的滑動鉗。然後核心酶與原來的滑動鉗解離,轉移到新的滑動鉗上,開始新的岡崎片段合成。

大腸桿菌複製體結構。Cell Cycle. 2009

長號模型也適用於真核生物,但具體細節有所不同。真核的活性解旋酶是CMG(Cdc45、Mcm2-7和GINS複合物),滑動鉗是PCNA,鉗加載器是RFC(複製因子C)。真核的一個顯著特點是前導鏈與滯後鏈的複製酶不同,前導鏈用Polε,滯後鏈用Polδ。

真核複製體結構模型。Annu Rev Biochem

Polα作為引發酶,合成引物並延伸約20-30個核苷酸。RFC識別引物並加載滑動夾PCNA。之後由聚合酶δ和ε進行合成。真核複製叉的移動速度大約為每分鐘1-2 Kb。

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