摘 要：目的 研究川芎揮髮油體內配伍替莫唑胺對C6膠質瘤大鼠抗腫瘤效果及作用機制。方法 製備C6膠質瘤大鼠模型，對比替莫唑胺單獨給藥、川芎揮髮油與替莫唑胺配伍給藥後大鼠的體質量、生存狀態、腫瘤體積的變化及抑瘤率；HPLC法測定替莫唑胺單獨給藥、川芎揮髮油與替莫唑胺配伍給藥後，替莫唑胺在膠質瘤U87-MG細胞內、外液中的濃度，並進行統計學分析；Western blotting法研究替莫唑胺單給藥、川芎揮髮油與替莫唑胺配伍給藥後對U87-MG細胞P-糖蛋白（P-gp）表達的影響。結果 與替莫唑胺單獨給藥比較，川芎揮髮油與替莫唑胺配伍給藥後大鼠腫瘤體積顯著減小（P＜0.05），與川芎揮髮油用量呈正相關，同時配伍組大鼠體質量上升趨勢更快，生存狀態較好。川芎揮髮油可以促進替莫唑胺進入U87-MG細胞內液中，且隨著揮髮油濃度的增加，促進作用越強。其中6.25×10−3μL/mL川芎揮髮油可顯著增加替莫唑胺在細胞內液中的蓄積（P＜0.05）。Western blotting實驗結果表明，與替莫唑胺組比較，替莫唑胺和3.125×10−3、6.250×10−3 μL/mL川芎揮髮油配伍後，可極顯著降低P-gp蛋白的表達水平（P＜0.01）。結論 川芎揮髮油可通過下調P-gp蛋白的表達，促進替莫唑胺進入膠質瘤細胞內，發揮協同抗腫瘤作用。
膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，據文獻報導，中國腦膠質瘤年發病率為3～6人/10萬人，年死亡人數達3萬人。膠質瘤為浸潤性生長，和正常腦組織沒有明顯界限，難以完全切除，對放療、化療不甚敏感，非常容易復發，至今仍是全身腫瘤中預後最差的腫瘤之一。將抗腫瘤藥物與引經藥聯合使用，增加治療藥物靶區的濃度，是提高腦膠質瘤治療效果的有效手段。王南卜等[1-2]發現β-細辛醚、冰片、蘇合香揮髮油、麝香酮均可促進替莫唑胺（TMZ）進入人膠質瘤U251細胞內，增強TMZ抑制腫瘤細胞增殖並促進細胞凋亡的作用，其機制可能是降低P-糖蛋白（P-gp）、多耐藥基因1（MDR1）的表達。Duan等[3]發現冰片可提高抗腫瘤藥物順鉑的腦組織瘤區轉運，其中下調緊密連接相關蛋白-1（ZO-1）、F-actin的基因及蛋白表達可能是其重要的作用機制之一。邢燕梅[4]證實天然冰片是通過激活Raf/MEK/ERK/MAPKs信號轉導通路，進而調控下遊相關緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的基因、蛋白表達和分布，從而調節腦血瘤屏障（BBTB）的通透性。
川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 辛散溫通、氣香走竄，能上行巔頂、下行血海、旁達四末、外徹皮膚，既能活血化瘀，又能行血中氣滯、疏散風邪，為血中之氣藥。吳霜霜等[5]分析了腦腫瘤中藥用藥規律，結果除全蠍和茯苓外，川芎的使用頻率最高。含有川芎的中藥複方在臨床上也常用於腦膠質瘤的治療，如腦瘤散、自擬腦瘤康[6]、自製膠質瘤方[7]、川芎三白湯[8]、滌痰化瘀通竅湯[9]、補陽還五湯[10]、平瘤合劑[11]等。這些研究提示，川芎可能具有促進配伍成分透血腦屏障（BBB）/BBTB，提高腦內、瘤內藥物治療濃度的作用。本課題組前期研究了川芎揮髮油（VO）中的3個入腦成分藁本內酯、洋川芎內酯A和洋川芎內酯I對BBB的調節作用，發現這3個成分可抑制BBB上P-gp蛋白的外排作用，增加配伍藥物芍藥苷、天麻素跨膜轉運量[12]。基於此，本研究製備C6膠質瘤大鼠模型，對比TMZ單給藥、VO與TMZ配伍給藥後，模型大鼠的體質量變化、生存狀態、腫瘤體積的變化及抑瘤率，從藥效學的角度研究VO是否具有提高配伍藥物抗膠質瘤的作用；對比TMZ單給藥、VO與TMZ配伍給藥後，TMZ在膠質瘤細胞U87-MG內、外液中的濃度，Western blotting法研究VO與TMZ配伍給藥後對U87-MG細胞中外排蛋白P-gp表達的影響，闡明其作用機制。
1 材料
1.1 藥品及試劑
TMZ，批號K19A9B58889，源葉生物科技有限公司；VO，批號20170614，其中總內酯質量分數為50.27%，藁本內酯質量分數為30.67%，陝西昊辰生物科技有限公司；聚山梨酯-80，Solarbio公司；ECM基礎培養基、胎牛血清（FBS）、青黴素-鏈黴素雙抗，Sciencell公司；Ham’s F-12K培養基、馬血清，美國Hyclone公司；FBS，美國Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亞碸（DMSO）、Hanks緩衝液、固體石蠟、樹膠、磷酸鹽緩衝液（PBS）、4×蛋白上樣緩衝液、0.22 μm PVDF膜、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8、10×電轉液、5×Tris甘氨酸電泳緩衝液、牛血清白蛋白（BSA）、20×TBS、彩虹245 plus廣譜蛋白Marker，Solarbio公司；P-gp抗體（Abcam公司）；GAPDH抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、HRP辣根酶標記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光劑、BCA試劑盒，天根生化科技有限公司；二甲苯、無水乙醇、甲醛均為西隴科學股份有限公司產品。
1.2 儀器
AE31倒置生物顯微鏡，麥克奧迪實業集團有限公司；01220數顯恆溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；SW-CJ-2FD超淨工作檯，蘇淨集團蘇州安泰空氣技術有限公司；Forma 3111二氧化碳恆溫培養箱，Thermo Electron公司；3-18K離心機，德國Sigma公司；Agilent1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；多功能酶標儀，Thermo公司；冰箱，青島海爾股份有限公司；腦立體定向儀，德國Kopf公司；電動牙科鑽，美國Foredom公司；微量注射
泵，美國KD Scientific公司；RM2255型包埋機、EG1150H型切片機、HI1210型攤片機、HI1220型烘片機均為德國萊卡公司產品；BX43型光學顯微鏡，日本Olympus公司；A-35型刀片，日本Feather公司；DNP-9052電熱恆溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；GL-6250A磁力攪拌器、TS-8脫色搖床，海門其林貝爾儀器製造有限公司；1645050電泳電源、1658001垂直電泳槽，BioRad公司；Chemiscope 6000 Pro螢光及化學發成像系統，上海勤翔科學儀器有限公司。
1.3 細胞及動物
大鼠C6膠質瘤細胞，上海中喬新舟生物科技有限公司；U87-MG細胞，北京北納創聯生物技術研究院；SPF級雄性Wistar大鼠，體質量220～240 g，南京君科生物科技有限公司，實驗動物許可證號SCXK（滬）2013-0016，由江西中醫藥大學實驗動物中心按SPF級動物標準飼養。
2 方法
2.1 細胞培養及處理
C6細胞加入適量含有15%馬血清、2.5% FBS的Ham’s F-12K培養液，置於37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。取對數期細胞，常溫下經0.25%胰酶消化，吹打細胞製成細胞懸液，將細胞轉置於離心管中，細胞計數板計數，用臺盼藍排斥實驗確定細胞存活率，需存活率＞95%。離心管中剩餘細胞以1 000r/min離心3 min，棄去上清液，調整細胞密度為7×107個/mL用於接種。U87-MG細胞培養基為含10% FBS的DMEM，培養方法同C6細胞。
2.2 大鼠腦膠質瘤模型的製備
術前12 h大鼠禁食、不禁水，用10%水合氯醛（3.5 mg/kg）ip麻醉，俯臥固定於大鼠腦立體定位儀，剔去頭部皮毛，酒精進行術區消毒，以內眥連線與頭部正中矢狀面交點位置右移3 mm，向後做約1.5 cm的縱向切口，分離皮下組織與骨膜，充分暴露顱骨。據Batker法確定右尾狀核靶點，於冠狀縫與正中矢狀線交點前1.0 mm、中線右3.0 mm處用電鑽鑽一小孔，不可傷及硬腦膜及腦組織。25 μL微量注射器吸取已準備好的待用C6細胞懸液15 μL（約1×106個細胞），放置於微量注射泵上，沿電鑽鑽開的骨孔緩慢垂直進針至硬膜下6.0 mm，1.0 min後再回退1.0 mm（距硬膜下5.0 mm）。將注射速度設置為1.5 μL/min，10 min推注完畢，需再留針5 min，使細胞充分沉積，再緩慢退針，退針速度為2 μL/min，骨孔用骨蠟進行封閉。縫合切口後用碘伏再次消毒皮膚。
2.3 大鼠分組與給藥
大鼠接種C6細胞2周後，隨機抽取5隻，取瘤區腦組織做病理切片，判斷模型複製是否成功。若鏡下見梭形細胞呈浸潤性生長，細胞異型性明顯，核分裂相易見，腫瘤微血管豐富，中心有明顯的出血及柵欄狀壞死，表明造模成功。隨機將製備成功的模型大鼠分為模型組（給予雙蒸水）、TMZ組（25 mg/kg）、TMZ＋VO低劑量組（TMZ/VO 2.5，25 mg/kg＋2.5 mg/kg）、TMZ＋VO高劑量組（TMZ/VO 5，25 mg/kg＋5 mg/kg），每組15隻，ig給藥，連續給藥5 d，給藥體積為10 mL/kg。
2.4 大鼠生存狀況觀測
從造模第1天開始至給藥結束後，每日觀察、記錄大鼠的精神狀況、活動情況、體質量變化、行為改變等生存質量情況。
2.5 大鼠腫瘤病理學研究
將給藥後的大鼠每組取3隻，10%水合氯醛過量麻醉，頸椎脫臼處死，取腦，生理鹽水清洗乾淨，固定於10%甲醛固定液中2 d，石蠟包埋、切片（厚度為3 μm），HE染色，光學顯微鏡下觀察腫瘤的形態學變化。
2.6 大鼠膠質瘤體積及抑瘤率測定
各組大鼠給藥後10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定，以橫膈肌處為起點，將胸部皮毛、肌肉組織剪開，切開縱膈肌，將兩側肋骨剪斷，用止血鉗夾住前胸肋骨劍突向上翻起，以便暴露心臟，用鑷子將心臟固定，將灌注針從左心室插入主動脈弓起始部，用止血鉗固定心臟及針頭，剪開右心耳，先用300 mL 37 ℃生理鹽水進行快速灌注，再用200 mL 4%多聚甲醛固定液20 min內勻速灌注。灌注完畢後，開顱，將腦組織完整取出，在4%多聚甲醛溶液內固定1周。將腫瘤組織從腦內完整的剝離取出，稱質量，並測量腫瘤短徑（a）和長徑（b），計算腫瘤體積（V）及腫瘤體積抑制率，腫瘤體積抑制率＞30%，表明腫瘤對藥物敏感。
V＝a2×b×π/6
腫瘤體積抑制率＝(V模型－V治療)/V模型
2.7 U87-MG細胞分組與給藥
取U87-MG細胞製成細胞懸液，調整為2.0×105～2.5×105個/mL，接種於6孔板中，每孔2 mL，待細胞融合至80%後，分為TMZ組（20 μg/mL）和TMZ＋VO低、中、高濃度（20 μg/mL＋1.562 5×10−3、3.125×10−3、6.25×10−3 μL/mL）組，移液槍吸盡每個孔中的培養液，分別加入2mL相應溶液。培養24 h後，收集培養上清液即為細胞外液。胰酶200 μL對貼壁細胞進行消化，消化5 min，1 200 r/min離心5 min，超聲3 min，1 200 r/min離心5 min後取上清液即為細胞內液。吸取100 μL的細胞內、外液，加入100 μL醋酸乙酯，渦旋5 min後，再以12 000 r/min於4 ℃離心10 min，取上清液採用HPLC檢測。
2.8 HPLC測定細胞內、外液中TMZ水平
2.8.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex NB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）；流動相乙腈-0.1%甲酸水1∶9，體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL，檢測波長為329 nm。
2.8.2 方法學考察
（1）專屬性考察：精密吸取TMZ對照品、Hanks液、細胞內液及細胞外液樣品，按「2.7」項下方式進行處理，在「2.8.1」項下色譜條件下進樣5 µL進行檢測，考察專屬性。TMZ在此液相條件下，保留時間為5.5 min左右，Hanks溶液對TMZ的測定無幹擾。
（2）精密度試驗：取適量的TMZ對照品儲備液，製成質量濃度為1.25、5、10、20μg/mL溶液，按「2.8.1」項下色譜條件進樣測定，連續進樣6次，測定其峰面積，結果TMZ的峰面積RSD分別為2.17%、0.76%、0.86%、1.05%，表明儀器的精密度良好。
（3）回收率試驗：取TMZ對照品溶液，加雙蒸水配製成低、中、高3個質量濃度；取TMZ對照品溶液，加Hanks液配製成低、中、高3個不同質量濃度溶液，按「2.7」項下處理方法進行操作，平行配製3份，按「2.8.1」項下色譜條件，精密進樣5 µL，測定峰面積，計算回收率和RSD值。結果TMZ低、中、高濃度的回收率分別為83.0%、85.3%、85.1%，RSD值分別為2.34%、4.66%、4.28%。表明回收率良好。
2.9 Western blotting法檢測P-gp蛋白表達
U87-MG細胞製成細胞懸液，以1.0×106個/mL接種於25cm2培養瓶中，置於37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，細胞生長融合至90%後，分為對照組、TMZ組（20μg/mL）和TMZ＋VO低、中、高濃度（20 μg/mL＋1.5625×10−3、3.125×10−3、6.25×10−3 μL/mL）組。藥物作用8h後，RIPA法裂解並提取蛋白，−20 ℃保存。採用Western blotting法檢測P-gp蛋白表達，灰度分析使用Image J軟體進行分析。
2.10 統計學分析
採用SPSS21.0統計軟體分析，數據以表示，2組間結果比較釆用t檢驗，多組間比較採用單因素方差分析（One-way ANOVE）。
3 結果
3.1 大鼠的體質量變化及生存狀態分析
結果見圖1，造模前各組大鼠體質量無統計學差異，造模後當天給予充足飼料，第2天觀察大鼠已開始自行覓食、飲水。術後大鼠食物和水的攝入較術前均有減少。模型組大鼠術後出現精神狀態萎靡不振，毛髮不整潔、黯淡無光，反應遲鈍，活動量減少，聚集成堆等表現，個別伴有腹瀉等症狀，體質量下降明顯；7～14d大鼠暴躁易怒，攻擊力增強，多數有明顯的腦部腫起，部分出現眼眶周圍出血、鼻出血、偏癱等顱內高壓的症狀。TMZ、TMZ/VO2.5和TMZ/VO 5組大鼠術後14 d內精神狀態及顱內高壓症狀表現與模型組相同，連續給藥5 d後，部分大鼠頭部的腫起逐漸消失，毛髮光澤度較模型組光亮；14 d後給藥組大鼠體質量有緩慢上升的趨勢，TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5組大鼠給藥後體質量比模型組及TMZ組大鼠上升更快，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。
3.2 大鼠腦膠質瘤形態學變化
HE染色結果見圖2，模型組大鼠腫瘤細胞排列非常緊密，細胞體積較大，可見裸核，核體積大，核漿的比例有所增加，有大量的異型性細胞增殖，並向腦組織呈浸潤性生長，多見不成熟新生血管，病灶中心部位壞死灶和出血。TMZ、TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5組大鼠腦組織中腫瘤體積明顯縮小，TMZ/VO2.5和TMZ/VO 5組大鼠腦膠質瘤細胞排列緊密程度顯著輕於模型組，與TMZ組比較細胞密度也略有降低。
3.3 大鼠腫瘤體積及其抑制率
連續給藥5 d後，與模型組比較，TMZ、TMZ/VO 2.5和TMZ/VO5組大鼠腦膠質瘤體積明顯減小（P＜0.05、0.01），見圖3。TMZ、TMZ/VO 2.5、TMZ/VO 5組大鼠腫瘤抑制率分別為55.23%、63.56%、74.66%，所有給藥組腫瘤體積抑制率均＞30%，表明腫瘤對治療敏感。TMZ/VO 5、TMZ/VO2.5組與TMZ組比較差異顯著（P＜0.05），提示與VO配伍後可以提高TMZ的抗腫瘤效果，且呈劑量依賴性，表明VO增強TMZ抗腫瘤效果與給藥劑量有關。
3.4 VO對U87-MG細胞內、外液中TMZ濃度的影響
表1結果可以看出，VO可以促進TMZ進入U87-MG細胞內液中，且隨著VO濃度的增加，促進作用越強。其中VO 6.25×10−3 μL/mL可顯著增加TMZ在細胞內液中的蓄積（P＜0.05）。
3.5 TMZ配伍VO對U87-MG細胞P-gp蛋白表達的影響
U87-MG細胞分別經空白Hanks液、TMZ、不同濃度VO配伍TMZ處理後，細胞膜上P-gp蛋白表達情況見圖4。結果發現，與對照組比較，TMZ對P-gp蛋白表達無顯著影響。與TMZ組比較，TMZ與VO 3.125×10−3、6.250×10−3 μL/mL配伍後可顯著降低P-gp蛋白表達水平（P＜0.05、0.01），表明VO通過抑制外排蛋白P-gp蛋白表達，增加TMZ進入膠質瘤細胞膜內的濃度，從而提高膠質瘤的治療效果；同時該抑制作用與VO用量呈正相關，用量越大，抑制作用越強。
4 討論
腦膠質瘤是最常見的顱內惡性原發性腦腫瘤，致死率高，由於其浸潤性生長，和正常腦組織沒有明顯界限，手術難完全切除，對放療、化療不甚敏感，因此腦膠質瘤至今仍是全身腫瘤中預後最差的腫瘤之一。研究者利用腫瘤表面特異性高表達的受體作為藥物遞送系統作用靶點構建一級靶向[13-15]給藥系統，以及在一級靶向的基礎上增加腦靶向的二級靶向[16-18]。雖然臨床前實驗結果顯示了這些靶向製劑的優越性，但由於系統的合成製備相對來說比較複雜，可控性差，存在安全性等諸多問題[19]，可能會限制其在體內的應用及向臨床的轉化。中醫藥在治療腦腫瘤時常常配伍使用芳香開竅藥，利用芳香開竅藥對BBB/BBTB的調節作用可提高配伍藥物的療效，並隨著該作用機制的逐漸闡明，現已廣泛與化學藥物聯用發揮協同作用，成為治療腦腫瘤的有效途徑。目前研究較多的芳香開竅藥如β-細辛醚、冰片、蘇合香揮髮油、麝香酮等，被發現能增加配伍藥物抗膠質瘤的效果[2]。
川芎可提高酸棗仁皂苷A和天麻苷元在腦組織中的濃度，並延緩其在腦組織中的代謝[20-21]。川芎中的川芎嗪可以通過降低咬合蛋白（occludin）、閉合小環蛋白（ZO-1）表達從而增加BBB的通透性[22]。川芎嗪的轉運受到P-gp的外排作用，但與其他藥物配伍使用時，川芎嗪能通過抑制P-gp的表達來促進藥物透過BBB[23-24]。VO中的3個入腦成分藁本內酯、洋川芎內酯A和洋川芎內酯I可抑制BBB上P-gp蛋白的外排作用，增加配伍藥物芍藥苷、天麻素跨膜轉運量，同時還可以抑制ZO-1和Claudin-5蛋白的表達，增加BBB的通透性，從而增加配伍藥物的跨膜轉運。由於膠質瘤的治療同時受到BBB/BBTB生物屏障作用及外排蛋白耐藥性的影響，推測川芎可能同樣有協同配伍藥物治療膠質瘤的作用[12,25-26]。
基於此，本研究製備了C6膠質瘤大鼠模型，連續給藥5 d後，TMZ、TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5組部分大鼠頭部的腫起逐漸消失，毛髮光澤度較模型組更加光亮；各給藥組大鼠體質量有緩慢上升的趨勢，TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5組大鼠比模型組及TMZ組體質量上升更快，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。另外，與TMZ組比較，TMZ/VO 2.5、TMZ/VO 5組大鼠腫瘤體積顯著減小（P＜0.05），提示VO配伍TMZ給藥時，可以增強TMZ的藥效，提高腦膠質瘤的抑制率，且呈劑量依賴性。
TMZ及VO對膠質瘤細胞活性的影響較大，預試驗時，TMZ 20 μg/mL組細胞存活率為97.85%、而濃度增加到40 μg/mL時，細胞存活率降至77.64%；而VO 6.25×10−3 μL/mL配伍TMZ 20 μg/mL時，細胞存活率為73.70%，當VO增加到12.5×10−3μL/mL時，細胞存活率降為52.65%，為保證細胞存活率，用於檢測細胞內、外液中TMZ的濃度，VO在體外細胞實驗時濃度選擇比體內實驗時低很多。HPLC檢測TMZ配伍VO對細胞內外TMZ含量的影響，結果顯示VO可以促進TMZ細胞進入U87-MG細胞內液中，且隨著VO濃度的增加，促進作用越強。其中VO 6.25×10−3 μL/mL可顯著增加TMZ在細胞內液中的蓄積（P＜0.05）。Western blotting實驗結果表明，VO通過抑制外排蛋白P-gp蛋白表達，增加TMZ進入膠質瘤細胞膜內的濃度，從而提高膠質瘤的治療效果；同時該抑制作用與VO用量呈正相關，用量越大，抑制作用越強。
本研究探討了VO通過抑制P-gp蛋白表達，促進TMZ進入膠質瘤細胞內部，從而發揮協同增效的作用，為臨床腦膠質瘤的治療提供一定的實驗和理論基礎，但其協同機制是否與緊密連接蛋白以及其他轉運蛋白有關，仍有待於進一步深入研究。
參考文獻（略）
來 源：吳海霞，劉姍姍，胡鵬翼，李 菁，鍾 鈺，鄭 琴，楊 明. 川芎揮髮油調控P-糖蛋白協同替莫唑胺的膠質瘤治療作用及機制 [J]. 中草藥, 2019, 50(22):5492-5498.