原創 | 劉sir
藥物研發領域小白，對藥物研發曲折歷程有濃厚興趣，願與諸君共同學習。
摘要
伊馬替尼的上市開創了靶向藥物分子治療的新領域，但是「道高一尺，魔高一丈」，伊馬替尼的反覆服用，容易刺激Bcr-Abl激酶發生變異，這也是白血病細胞產生伊馬替尼抗性的主要原因，儘管格列衛（伊馬替尼）耐藥期相對較長，但是，只要患者服用，總有一天會耐藥的。
那麼，對於治療耐受伊馬替尼的慢性粒細胞白血病（CML）患者怎麼辦呢？帕納替尼（ponatinib）將是最好的選擇！
帕納替尼雖然上市晚於伊馬替尼10年，卻是針對伊馬替尼耐藥的患者，其研發過程做到了精雕細刻的考察、反覆地驗證，整個過程是嚴謹的、是艱辛的，研發的源頭性和路徑上也具有獨立和獨創的品格。
01、源於骨質疏鬆藥物的研究
帕納替尼開始的研究並沒有借鑑和模擬伊馬替尼的思路，而是源於研究骨質疏鬆藥物。實驗證明，Src過表達可引起骨質疏鬆，Src基因敲除小鼠可避免骨質疏鬆的發生。基於此，ARIAD公司以Src激酶為靶標研製抗骨質疏鬆藥物。選擇嘧啶並吡咯和嘧啶並吡唑類化合物作為篩選苗頭，源於諾華和輝瑞公司曾報導過這類化合物具有活性。ARIAD發現化合物1抑制Src激酶IC50值40 nmol·L-1, 進而變換結構，化合物2和3的IC50值分別為4 nmol·L-1和20 nmol·L-1。
在研究上述內容的同時，ARIAD還啟動了以依賴周期蛋白激酶(CDK)為靶標，研發抗骨質疏鬆的課題。2,6,9-三取代嘌呤化合物purvalanol A(4)是CDK強效抑制劑。化合物4抑制CDK2的活性IC50高達70nmol·L-1，但抑制與骨質疏鬆相關的Src激酶活性不高，IC50=0.24μmol·L-1，由此設計合成了在嘌呤2,6,9-位變換不同取代的化合物。
將化合物4中2位的異丙基去除後，活性降低6倍；再將9位的異丙基換成間羥基苯乙基，活性提高60倍，這提示9位為大片段有利於同靶標的結合。6位的氯苯基去除氯原子後活性幾乎不變，但是2位烷胺基換成環戊基時活性略有下降，而6位的苯環對位連接氧化膦基或亞甲二膦酸基時，對Src激酶抑制活性顯著提高，其中化合物9活性最高，IC50=0.45nmol·L-1，代號為AP23464，為裡程碑式化合物。
02、轉向研究CML的雙重抑制劑
持續服用伊馬替尼引起的耐藥性是由於激酶的突變，除了Abl變異之外，Src 酪氨酸激酶家族的Lyn、Hck和Lyn等也發生突變， ARIAD進而以耐藥的CML為目標，研究對Src/Abl雙靶標抑制的藥物。
化合物9對兩個激酶Src/Abl的抑制作用IC50都低於1 nmol·L-1， 根據化合物9與Src晶體結構信息，認為將亞乙基的柔性連接基剛性化，以固定末端苯環的取向，應能提高活性。用分子對接方法將N9連接的乙苯基變換成trans-乙烯苯10，由於雙鍵的定向作用，使苯基結合於激酶突變後產生的特異性疏水腔。同時也合成了cis-乙烯苯11以驗證對接結果。進而模仿達沙替尼的結構片段，合成了trans-乙烯2,6-二甲苯基化合物12和cis-乙烯2,6二甲苯基13，抑制酶和細胞的活性進一步提高。然而，化合物10和12對Src和Abl抑制活性相差較大, 為提高對Abl激酶的活性，將二丙膦氧基片段換為體積較小的二甲基化合物14，拉近了對Src和Abl的活性，為此固定二甲基膦氧基不變，變換N9乙烯基連接的芳環。
03、另一路徑—設計DFG-out構象的抑制劑
上述以化合物9為先導物所優化的雙重抑制劑，N9連接的片段所結合的位點是活化環套的DFG呈與ATP結合的狀態，即結合於DFG-in構象的抑制劑。同時進行的另一途徑是合成激酶的活化環套呈DFG-out構象的抑制劑，猶如伊馬替尼結合樣式。Abl激酶與抑制劑的晶體結構表明，當活化環套呈DFG-out構象時，抑制劑N9連接的二芳醯胺片段與酶形成了氫鍵網絡，故而設計了化合物15。
3.1 C6取代基的變換
活性評價結果證實，化合物15對Src和Abl都有較高活性，而且在10 μmol·L-1濃度下對正常細胞無作用，提示有高選擇性。大鼠藥代動力學實驗表明15的口服利用度F=20%，半衰期很短，是由於C6的甲胺基發生氧化去甲基作用。故而合成了環丙基化合物16(環丙基代謝穩定性高於甲基)，仍保持了酶和細胞活性，而改善了藥代，F=40%，血漿中有高暴露量。環丙基的親脂性強於甲基，推論進一步增高親脂性會有利於活性。為此合成了芳環17～22，吡啶和嘧啶化合物活性都很高，但2-吡啶基化合物17卻很低，可能是由於2'-N與嘌呤N1的電性排斥作用，芳環扭轉，破壞了共面性，而18和19沒有排斥作用(但嘧啶也有鄰位排斥作用，活性下降卻不明顯)。化合物21移植了9的模塊，Scr和Abl活性都比較高。22的活性很弱。然而這些高活性化合物的大鼠藥代都不好，因而將C6-環丙胺基固定做進一步優化。
3.2 N9連接片段的變換——借鑑尼洛替尼的設計
優化N9位置，借鑑了諾華的尼洛替尼的設計理念，合成了脲基和反向醯胺連接的化合物23和24。23幾乎沒有活性，而24的-CONH-比區域異構體16的-NHCO-活性強，猶如尼洛替尼活性強於伊馬替尼。為此，以24為新起點，優化末端芳環。構效關係表明，在三氟甲苯基環上再加入滷素(25、26)活性減弱，三氟甲基換成叔丁基(27)，對Src活性提高一倍多，但抑制Abl作用降低，提示這兩種激酶結合腔的差異。化合物28為異丙基，都比叔丁基弱。然而27親脂性過強，clogP=6.76，超過化合物24，綜合考慮27不可取。含叔丁基的芳雜環化合物中異噁唑29對Scr和Abl都很強，但大鼠藥代不如24。化合物30的活性優於24，而且親脂性比24降低10倍。有趣的是，將上市藥物尼洛替尼的「大塊片段」連接在醯胺上，化合物31活性非常高，說明該優化的模塊適用於本系列中，也意味著與激酶結合的相似性。
3.3 連接基乙烯基的變換
持續應用伊馬替尼可引起Abl激酶發生變異(AblT315I)，即門戶殘基Thr315 突變Ile315，T315I突變的後果。胺基酸側鏈由CH(CH3)OH變成CH(CH3)CH2CH3，不僅體積變大，空間上也阻礙了伊馬替尼的進入，而且失去形成氫鍵的能力(羥基O為氫鍵接受體)。化合物31對AblT315I激酶有中等強度的活性，提示該系列化合物的結構特徵對門戶殘基的Abl變異仍可結合。進而設想將乙烯基換成直線型的乙炔基更能解除位阻效應。為此將乙烯基和乙炔基與有強結合作用的芳環進行組合優化。
化合物33與32比較(同樣35與34相比)雖然對未變異的Abl的活性相近，但對變異的激酶活性(AblT315I)提高了30～40倍，這些結果說明乙炔基是優化的連接基。然而化合物33和35的藥代動力學性質不佳，且很容易被代謝消除，須進一步優化。
3.4 骨架遷越——更換嘌呤環
嘌呤和苯環之間的連接基是N-C≡C-C的炔胺結構時，化學和藥動學不如C-C≡C-C穩定，故試圖變換嘌呤環結構，合成一系列新的化合物。
化合物36和37對Abl的抑制活性很高，證明了骨架躍遷的成功，但是大鼠的藥代動力學不佳，可能是由於嘌呤環上的氨基或乙醯氨基導致的，故去掉氨基後，化合物38保持了對變異酶的活性，而且改善了大鼠藥代，口服利用度42%。但Abl的活性弱於36和37。在咪唑環上加入助溶基團後，39和40的活性仍不高，還得以新的途徑優化活性。
3.5增加與活化環套的結合——模擬伊馬替尼的結構設計
在已有優化的基礎上再提高與AblT315I酶的結合作用，探索增加與活化環套(A-loop)的殘基結合。
合成化合物41的活性結果表明，對AblT315I激酶活性比38提高2倍，Abl提高20倍，而且在高濃度(340 μmol·L-1)人血漿白蛋白存在下對白血病細胞抑制活性並不減弱，提示與血漿蛋白結合的較少，因而成為一個很好的突破口。若將哌嗪片段移至5位，活性減弱，提示位置的重要性。下一步優化鹼性片段都在苯環的4位。
變換鹼基片段的活性結果表明，化合物41的哌嗪N4被氧原子替換，嗎啉化合物42活性顯著減弱，佐證了N4形成氫鍵的重要性。43和44分別為縮環和擴環化合物，雖然也存在類似於哌嗪N4的氮原子，但這兩個化合物的活性弱於41，將41的N-CH3換成較大的烷基或氟(或羥)乙基(48、49)都不利於抑制突變株。
3.6母核吡咯並吡啶的再檢討
當初去除氨基以改善藥代效果時，雖然損失了一些活性（權衡結果划算），現為了彌補損失，合成了一系列增加雜環內的NH的衍生物，以提供氫鍵給體。
化合物52～55的活性表明，52和55對變異激酶的活性略有提高，但是53和54的活性降低。另一思路是，為了降低41的親脂性(clogP=6.69)，在吡唑並吡啶環的不同位置加入一個氮原子(加一氮原子分配係數降低1個對數單位)，化合物57和58活性顯著提高，尤其是57。56的低活性是由於雜環的8位是用氫鍵接受體佔據了氫鍵給體的位置，從而發生互相排斥的緣故。58的大鼠藥代優於57，下一步是對母核換作咪唑並吡啶後的繼續優化。
3.7 新骨架的各取代基的綜合調整
以58為新一輪優化的起點，在苯環A的2位變換甲基，苯環B的3,4位變換三氟甲基和鹼基，對結構進行微調，化合物及其活性如下：
得出還是化合物58的活性最佳。
3.8候選化合物的藥代性質
化合物58勝出為候選化合物，與各個裡程碑化合物作了藥代動力學比較， 58大鼠灌胃的生物利用度18%，半衰期11h，靜脈注射的清除率0.65 L·h-1·kg-1。58定名為帕納替尼(ponatinib)，臨床前和臨床實驗，表明對慢性粒細胞白血病和費城染色體陽性的急性白血病有效，於2012年經美國FDA批准上市。
小結
帕納替尼是一個線型分子，它的研製涉及了整個分子所有的基團和片段的優化，雖然同類產品伊馬替尼在它10年前面市，也在設計上有所借鑑，但仍不失為創新性藥物。在分子設計−合成−評價−構效關係分析的循環反饋中，結構生物學、分子模擬和藥物化學的交織應用與印證，對結構的各個側面做到了精雕細刻的考察，甚至是反覆地驗證。
參考資料
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原標題：守護健康，抵抗耐受——帕納替尼的研發之旅