專家點評Science|揭示高等哺乳動物再生能力丟失的機制

點評丨荊清 研究員、熊敬維 教授

責編丨兮

器官再生現象在自然界中廣泛存在，但是不同物種間再生能力卻是非均勻分布的。低等脊椎生物如魚類、蠑螈等，具有極強的器官再生能力，他們可以再生受損的心臟、大腦、脊椎及肢體；相比之下，高等哺乳動物（包括人類）卻在進化過程中丟失了這些讓人夢寐以求的再生能力。現代再生醫學的一項重要任務就是幫助人們恢復因疾病、衰老或其它原因造成損傷器官的功能，然而迄今為止，我們仍然不清楚高等哺乳動物再生能力因何丟失。

2020年9月4日，美國斯託瓦斯醫學研究所（Stowers Institute for Medical Research）、霍華德·休斯醫學研究所（Howard Hughes Medical Institute）的王偉博士、Alejandro Sánchez Alvarado院士（美國國家科學院，美國藝術與科學院）與史丹福大學Anne Brunet教授團隊合作在Science雜誌上以長文形式發表了題為 Changes in regeneration-responsive enhancers shape regenerative capacities in vertebrates 的研究【1】。該研究首次引入新再生模型——非洲鱂魚（African killifish Nothobranchius furzeri，圖1），通過比較研究提出解釋動物再生能力丟失的基於再生響應增強子（regeneration-responsive enhancer）的理論模型 （圖2）。

該理論認為原始再生響應增強子（ancestral regeneration-responsive enhancers）的功能是激活組織再生，該過程包括損傷響應（injury response，可以啟動傷口癒合）和再生響應（regeneration response）。然而在進化和物種形成（speciation）過程中，激活損傷響應和再生響應的功能在一部分再生響應增強子中被分離。在有些動物中，再生響應增強子仍保留激活損傷響應和再生響應的功能，因而這些動物保留再生能力。然而在另一些動物中（包括人類），再生響應增強子由於增強子功能性調整（enhancer repurposing）發生了變化，致使他們只能激活損傷響應而不能激活再生響應，因此丟失了器官再生能力。

圖1：非洲鱂魚模型的優勢。

圖1：非洲鱂魚模型的優勢。（該模型具有三大優點：第一，生長周期短，30-45天即可性成熟，因此極大地節省了遺傳操作時間【2】；第二，壽命極短（平均壽命為六個月，是目前實驗室可飼養的壽命最短的脊椎動物），是衰老研究的理想模型【3】；第三，胚胎發育可以停滯並進入休眠或滯育 （diapause），休眠期可達兩年以上【4】，是保存重要實驗動物品系的理想方式，極大節省了動物飼養空間及人力物力。）

長期以來，器官再生研究多限於單一物種的研究，通常默認器官再生存在保守機制，然而在分子水平上不同物種間器官再生的相似度到底有多高從未有人系統研究過。

在該項研究中，研究人員首先比較了生存在兩種完全不同環境中的非洲鱂魚和斑馬魚的尾鰭再生。非洲鱂魚生活在辛巴威和莫三比克等地區的季節性水塘裡，承受著極大的季節性乾旱的自然選擇壓力；為了適應這樣的環境，非洲鱂魚發育及衰老速度極快。斑馬魚生活在喜馬拉雅山脈下的小溪裡，受乾旱的選擇壓力較小。儘管這兩種魚的尾巴經受損傷後都能再生，但意外的是他們響應尾部再生的基因和增強子差異很大，這一結果直接說明器官再生受到進化選擇的壓力。

進一步，作者與曾安博士（現為上海生化與細胞所研究員，主要研究方向是幹細胞和器官再生，實驗室主頁www.sibcb.ac.cn/zenglab）及胡德慶博士（現為天津醫科大學基礎醫學院教授）合作，利用單細胞測序和表觀遺傳學技術，比較兩種魚尾部再生的細胞類群及再生響應增強子的變化，鑑定出一個進化上保守的再生響應程序（regeneration response program）。

以inhba 基因為例，研究人員發現在器官損傷後，該再生響應程序包含的基因通過再生響應增強子在器官損傷後被激活。進一步研究發現，經基因編輯而丟失inhba再生響應增強子的非洲鱂魚喪失心臟再生能力，同時尾巴再生速度減慢，說明再生響應增強子對器官再生是必須的。緊接著研究人員想弄清楚，對再生必須的增強子是否會受選擇壓力而進化。若能進化，則說明再生響應增強子的進化可能是再生能力在脊椎動物中不均勻分布的一個重要原因。因此，研究人員比較了不同物種中inhba再生響應增強子在轉基因非洲鱂魚中的活性差異。研究發現， 與非洲鱂魚相比，斑馬魚的inhba再生響應增強子功能高度保守，而人類的inhba再生響應增強子卻發生增強子功能性調整。該功能性調整導致人源inhba再生響應增強子無法拯救（rescue）非洲鱂魚增強子缺失突變體的表型。最後研究人員還發現，再生響應增強子的激活依賴於AP-1轉錄因子複合體。綜合以上研究結果，研究人員首次建立了基於增強子的理論模型以解釋進化過程中哺乳動物再生能力丟失或者顯著減弱的現象（圖2）。

圖2 ：再生能力丟失的理論模型

該研究對於理解組織器官再生的分子機制具有重要的意義：首先、提出了高等哺乳動物（包括人類）在進化過程中器官再生能力丟失的一個潛在機制，為器官再生研究和再生醫學開闢了新的思路；其次、由於存在大量物種特異性的器官再生響應，該研究提示了利用單一物種進行再生機制研究的局限性，以及利用多物種進行比較研究再生機制的必要性。

原文連結：https://science.sciencemag.org/content/369/6508/eaaz3090

專家點評

荊清 研究員（中國科學院上海營養與健康研究所，博士生導師）

器官再生是21世紀生命科學研究的焦點之一。自18世紀中葉瑞士博物學家Abraham Trembley首次描述水螅（hydra）超強的再生能力之後，器官再生研究不斷取得重大突破。然而，仍有眾多的重大科學問題未曾解決，比如為什麼哺乳動物（包括人類）的再生能力非常有限，而渦蟲和魚類等低等生物卻具有極強的再生能力？

美國斯託瓦斯（Stowers）醫學研究所Alejandro Sánchez Alvarado院士團隊和史丹福大學Anne Brunet教授團隊合作完成的，以王偉博士為第一作者的發表在Science雜誌上的一項研究提出了基於再生響應增強子的理論模型解釋脊椎動物中器官再生能力不均勻分布的現象。該研究突破常規思路，通過利用單細胞測序技術、轉錄組測序和表觀遺傳學技術比較了兩種生存在不同自然選擇壓力下的硬骨魚（teleost）（非洲鱂魚和斑馬魚）的器官再生，解析了器官損傷後的細胞響應，揭示了物種特異性的再生響應在分子和遺傳水平廣泛存在，而進化保守的器官再生響應程序（regeneration response program）在整個再生響應過程中只佔較小的比例。這一發現對未來器官再生研究具有重要的指導意義，有望突破以往基於單一物種再生研究中存在的局限性。再生響應增強子（regeneration responsive enhancer， RRE）是近年來再生領域裡的新概念。這項研究首次證實inhba再生響應增強子對器官再生是必須的，而且發現人類基因組中該增強子因發生功能性調整而喪失激活再生的能力。這一令人興奮的發現為解開器官再生的奧秘、尋找激活再生程序的方法開闢了新思路，對再生醫學具有重要的啟示作用。

另外值得一提的是王偉博士在Alejandro Sánchez Alvarado教授團隊建立的非洲鱂魚遺傳模型具有獨特的優勢，對推動再生、衰老，發育等領域的研究具有重要意義。它是目前在實驗室可飼養的壽命最短的脊椎動物，目前世界上已有多個團隊將其作為衰老模型。該魚生長速度極快，因而可為遺傳操作節省大量時間；其特有的胚胎自然休眠更是為重要遺傳品系的保持提供了極大的便利，大大節省了人力和飼養空間，降低了研究成本。該動物模型已有相對完善的配套分子及遺傳學技術，比如高質量的基因組信息、CRISPR/Cas9技術、基於Cas13d的基因knockdown技術、基因過表達、高效快速的轉基因技術等。

熊敬維 教授（北京大學分子醫學研究所，博士生導師）

器官再生潛能的獲得或丟失是再生生物學領域的關鍵科學問題，美國Stowers研究所和HHMI研究員Sánchez Alvarado實驗室王偉博士及同事在最新一期Science雜誌報導再生增強子在調控器官再生的重要工作。基於模式動物的內源性器官再生研究近年來得到廣泛認可，主要模式動物包括渦蟲、斑馬魚、蠑螈和小鼠等，這個工作又增加了非洲鱂魚（African killifish）系統，以往的研究發現FGF, Hippo/YAP, Neuregulin等多種信號是器官再生必需的，但一般認為還沒有找到能夠誘導無或低再生潛能的器官進入再生的關鍵信號通路。對不同物種的基因組序列進行比較分析的結果顯示大多數動物的蛋白編碼基因數量和基因同源性相對類似，但是非編碼基因組序列的序列和功能變化巨大，所以科學家試圖探討基因增強子、表觀因子（DNA修飾和組蛋白修飾）、非編碼RNA和基因組重複系列等在物種進化、形態多樣性和器官再生等生物學過程中的作用。前期工作報導順式調控元件或增強子在物種形態進化過程 (Wray GA, 2007 Nat Rev Genet; Carroll SB, 2008 Cell)，斑馬魚器官再生（Kang et al., 2016 Nature; Goldman et al., 2017 Dev Cell；Thompson et al., 2020 Development），果蠅翅原基再生（Harris et al., 2016 eLife）中的功能。基於上述研究，王偉博士等假設動物進化過程中可能存在重要的器官再生增強子，這項工作首次從跨物種進化角度入手發現了一些序列進化保守的再生增強子。

過去的研究工作主要比較同一物種不同器官再生的增強子（Kang et al., 2016 Nature）, 王博士等從進化角度比較了斑馬魚和非洲鱂魚兩個物種的尾鰭再生增強子（H3K27ac）和啟動子（H3K4me3），結合尾鰭再生中基因表達分析和單細胞測序分析，發現49個再生增強子/基因，並且這些增強子在尾鰭和心臟可再生的動物（可再生的尾鰭和心臟再生模型）中相對保守，在耳廓可再生的非洲刺毛鼠 (Acomys cahirinus) 中49個再生增強子/基因有20個基因表達增強即功能保守，而在不可再生的小鼠 (Mus musculus) 中這些基因表達異常，表明這些再生增強子具有進化保守性。很有趣的是這些增強子主要在尾鰭再生中的關鍵細胞（blastema細胞）中激活，進一步支持它們可能在尾鰭再生中發揮功能。作者然後系統分析了再生基因inhba增強子K-IEN (非洲鱂魚) 和Z-IEN (斑馬魚) 的表達、功能和進化關係，發現增強子K-IEN/Z-IEN在尾鰭和心臟再生的blastema細胞/前體細胞中激活，而人的IEN（H-IEN）在其它非再生關鍵的細胞中激活，提示這個再生增強子在人中具有不同的功能。為什麼同一增強子元件序列上相對保守，卻在不同物種中發揮著不同的功能，是什麼導致了這種差異？這將是領域內的重要研究內容。利用基因編輯技術建立非洲鱂魚K-IEN突變體，發現這個增強子對尾鰭和心臟再生是必需的，但作者沒有探討這個增強子是否足夠誘導尾鰭或心臟再生比如誘導非損傷狀態下細胞增殖，尤其是否能夠誘導不可再生的成年哺乳動物器官再生。另外，目前有工作報導有些增強子並不能調控鄰近基因的表達 (Thompson et al., 2020)，因此找到這49個再生增強子調控基因也將有重要貢獻。最後作者通過生物信息分析，發現這些再生增強子富集AP-1結合位點，並且設計了一系列點突變實驗驗證AP-1結合核酸序列以及AP-1功能在再生中的作用。總之，這篇文章首次從進化角度研究器官再生的增強子，發現大量進化保守的器官再生增強子，提出再生增強子在器官再生潛能獲得（在再生關鍵細胞中的激活等）和再生潛能丟失（再生增強子表達異常/功能改變比如repurposing）中的功能。與近年來其它器官再生工作一致（Gehrke et al., 2019 Science; Beisaw et al., 2020 Circ Res）, 這篇文章發現AP-1及蛋白複合體在調控再生增強子的重要作用，這將指導今後研究AP-1複合體如何感知損傷信號和再生的機制。這篇富有創新性的高水平論文無疑將推進再生增強子的鑑定和功能研究，為人類揭示器官再生的奧秘提供新的研究思路和大量再生增強子/基因資源。

王偉博士簡介

本科畢業於西北農林科技大學，2014年獲得美國阿拉巴馬大學（University of Alabama）生物學博士學位。現為美國斯託瓦斯醫學研究所（Stowers Institute for Medical Research）、霍華德·休斯醫學研究所（Howard Hughes Medical Institute）的 博士後研究員。師從美國國家科學院院士、藝術與科學院院士、HHMI 研究員Alejandro Sánchez Alvarado教授。建立了具有顯著優勢的（例如，生長及性成熟速度慢，生命周期長，實驗動物飼養耗費大量人力、物力等等）、可用於動物器官再生、衰老和發育相關研究的新型動物模型——非洲鱂魚（African killifish N. furzeri）。主要研究方向是器官再生能力的分子基礎以及衰老引起的器官再生能力的丟失的遺傳機制。以第一作者和主要作者身份先後在Science, Nature, Cell, PNAS, Developmental cell等期刊發表重大研究成果。曾獲得2011年國家優秀自費留學生獎以及美國阿拉巴馬大學優秀研究生獎。

製版人：十一

參考文獻

1. W. Wang, C.K. Hu, A. Zeng, et. al., 2020. Changes in regeneration-responsive enhancers shape regenerative capacities in vertebrates. Science 369,2020.

2. M. Vrtilek, J. Zak, M. Psenicka, et. al., 2018. Extremely rapid maturation of a wild African annual fish. Current biology : CB 28, R822-R824.

3. I. Harel et al., 2015. A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate. Cell 160, 1013-1026.

4. C.K. Hu, W. Wang, et al., 2020. Vertebrate diapause preserves organisms long term through Polycomb complex members. Science 367, 870-874.