科研人員為什麼不能忽視支原體汙染的存在？

2020-10-17 DY締一生物

在培養細胞時，人們常常關注細菌和真菌的汙染，認為它們是細胞培養的主要幹擾因素。但其實，更嚴重的是支原體 的感染，它的發生率非常高，而且不易被發現。不僅普通光鏡下無法發現支原體，而且培養基也不容易變色。只有在汙染的後期培養基才容易變黃。下圖為支原體嚴重汙染後的表現：


那麼，支原體汙染為什麼發生率這麼高？

細胞培養中有幾種支原體汙染與人、牛和豬有關。實驗室的工作人員是口腔支原體、發酵支原體和人型支原體的主要來源。這三種支原體佔細胞培養中支原體汙染的一半以上，它們主要存在於人的口咽部。支原體也存在於人的頭髮、皮膚上。胰酶如果是豬來源的，那麼也可能存在豬鼻支原體。以下為支原體汙染的主要途徑。

因此，對於實驗室所培養的細胞，應進行支原體的定期監測。德國MB公司『支原體常規PCR檢測試劑盒』(如Venor® Gem OneStep試劑盒)是常用的支原體篩查用試劑盒，可用於細胞培養中是否存在支原體汙染的篩查。

它具有以下的特點：

①高特異性，270bp左右的一條陽性對照條帶，涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種，操作簡單，結果易於觀察。（根據16s rRNA序列的同源性比對，該試劑盒可檢測出1種脲原體、7種無膽甾原體和85種支原體。）

②高靈敏度。

③試劑盒含內控對照，可防止假陰性的發生。

(2)操作步驟

下列圖示以Venor® Gem OneStep支原體常規PCR檢測試劑盒(一步法)( 貨號：11-8050) 為例，具體產品操作以說明書為準。

第1步：樣本處理


第2步：試劑製備


第3步：PCR體系建立


第4步：啟動PCR反應


第5步：電泳結果分析


191bp為內控對照條帶，表明PCR反應正常。

當樣本存在支原體嚴重汙染時，由於內控對照與支原體DNA存在競爭，內控對照條帶變弱（例如支原體DNA＞103拷貝）。

陽性對照中支原體DNA＞10^4拷貝，內控對照條帶會完全消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結果。

如果待測樣本對PCR產生抑制，則內控對照條帶變弱（和陰性對照相比），此時應先進行DNA抽提，然後再檢測。


相關焦點

  • Nature:大量的細胞研究被支原體汙染摧毀
    又因為其缺乏細胞壁，所以常規的抗生素並不能對它們起到抵抗作用。由於支原體本身的特性，不易被清除，而導致實驗研究中資金和人力的極大損失。John Hogenesch每次看到自己的實驗員愁眉不展時，他立馬就知道是實驗出問題了，他會給與實驗員一個好的方法去查找失敗的原因——「檢查下細胞培養是否存在支原體汙染」。支原體汙染總是會影響研究的發現，並浪費大量的科研經費。
  • 不可小看支原體汙染問題
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  • 先看看有沒有支原體汙染
    這「一點」就是：支原體汙染！全世界範圍內，不同實驗室的科研人員在培養細胞時，發生支原體汙染的概率是10%-85%不等。支原體是最小的原核生物，大約0.2-0.3um, 可以透過濾膜(0.22-0.45 um)，因此被汙染細胞常常肉眼觀察不到。
  • 如何有效把支原體汙染趕出你的細胞?
    對於已耗費很多時間、大量擴增起來的細胞，或經過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞，如果發現細胞被支原體汙染了，怎麼辦？本文締一生物為您分析如何有效把支原體汙染趕出你的細胞？ 由於前期工作量巨大，我們無法丟棄已有細胞。
  • 細胞培養中的支原體汙染問題
    支原體無細胞壁形態呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態多變，在光境下不易看清部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構．其中央有電幹密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在於細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。
  • 實驗室細胞培養支原體汙染怎麼辦
    概述：在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體汙染是一個世界性的難題。細胞培養中常遇見的有細菌汙染、真菌汙染、支原體汙染、病毒汙染等。說起支原體汙染，估計細胞培養的同學就開始犯愁了，細胞培養的老手都知道，支原體汙染非常不易察覺。
  • 細胞中支原體的汙染檢測有如下幾種方法
    支原體最早發現於1898年，1956年Robinson等首次從細胞培養物中分離出支原體，之後國內外關於支原體汙染細胞的報導屢見不鮮。它廣泛存在於自然界中，有100餘種。現在只要是做細胞培養並發表論文，國際期刊就要求一定要做支原體檢測。一般要一周測一次支原體。
  • 細胞被支原體汙染是每個實驗室常見但不自知的事
    在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，（63%，多恐怖）因而細胞培養過程中被支原體汙染是一個世界性的難題。當細胞（特別是傳代細胞）被支原體汙染後，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般並未發生顯著的影響，因而細胞被支原體汙染一般難以察覺。 　　首先，什麼是支原體呢？
  • 細胞培養支原體汙染的判斷和處理方法
    支原體是一類無細胞壁、大小介於細菌和病毒之間（直徑在0.13～0.18 μm）並獨立生活的微生物，可穿過0.22 μm 的孔徑濾膜
  • 細胞培養的實驗室對支原體汙染預防有幾種預防
    支原體的汙染肉眼不易察覺，直到嚴重的階段才會出現培養基變色、細胞異常等情況。支原體可造成細胞代謝改變，基因表達譜發生變化，從而嚴重幹擾實驗進程。本文締一生物為您分析細胞培養的實驗室對支原體汙染預防有幾種預防。因此，在細胞培養過程中，定期監測是否存在支原體汙染，及時預防支原體汙染是每個科研人員的工作之一。
  • 同樣是細胞被支原體汙染，怎麼挑選支原體祛除劑
    養細胞時，除了支原體的檢測需要定期進行外，支原體的預防和祛除也是一個重要方面。它包括工作區域中的支原體的預防和祛除和培養箱水槽、水浴鍋中預防支原體的汙染。但一旦發生細胞培養時有支原體汙染，應如何挑選支原體祛除劑呢？這裡指的支原體祛除劑，是加入到細胞培養基中來發揮作用。德國MB有三種支原體祛除劑，都是加入到細胞培養基中使用。它包括：1.
  • 支原體汙染的影響是什麼?如何應對呢?
    細胞培養過程中，由於實驗環境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細胞發生支原體汙染的頻率很高。據美國數據統計，細胞發生支原體汙染的機率在70%以上。同時，由於支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到。因此，支原體汙染不易被實驗者肉眼發覺。而支原體汙染是個循序的過程，普通抗生素對其無效。
  • 支原體汙染引發細胞應激狀態的一則報導
    支原體寄生於人、動物、植物、昆蟲細胞，為寄生生活。 支原體容易附著於細胞表面，與宿主細胞胞膜融合併交換成分。 支原體無論是對於科研或臨床用的培養細胞，還是對於工業上的生產細胞，都會產生嚴重的危害，例如導致細胞基因表達譜改變，但更多具體的改變並不清楚。
  • 細胞被支原體汙染的危害有多大
    在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體汙染是一個世界性的難題。當細胞（特別是傳代細胞）被支原體汙染後，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般並未發生顯著的影響，因而細胞被支原體汙染一般難以察覺。
  • 細胞培養：關於支原體汙染的危害
    支原體汙染普遍存在，據美國數據統計，細胞發生支原體汙染的機率在70%以上。同時，由於支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到，不易被實驗者肉眼發覺，支原體汙染逐漸成為一個普遍存在的問題。本文締一生物為您分析細胞培養：關於支原體汙染的危害。
  • 哪些情況下細胞會被支原體汙染,紫外照射不一定能殺滅支原體
    細胞株若受到細菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之汙染時，會嚴重的影響實驗的結果。本文威正翔禹/締一生物為您分析細胞支原體汙染之一般情況。但是若受到支原體之汙染時，細胞之外觀較無明顯變化，但是其汙染會造成細胞之生長速率緩慢、細胞產生病變之型態改變等等變化。
  • 細胞培養出現支原體汙染的危害及檢驗方法
    支原體是目前已知一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小的原核細胞型微生物。細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體汙染是個世界性問題。國內外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和菜氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國外調查證明，大約有二十多種支原體能汙染細胞，有的細胞株可以同時汙染兩種以上的支原體。
  • 分享：一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法
    支原體汙染是細胞培養實驗中的常見問題之一，那如果細胞被支原體汙染不明顯，出現實驗結果難以理解，重複性差等問題如何解決呢，本文締一生物為您分享：一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法。分享：一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法常規PCR
  • 檢測細胞培養及生物製品的支原體汙染選用什麼呢
    支原體檢測試劑盒Venor®GeM OneStep採用常規PCR方法，並包含PCR需要的所有試劑。其中引物和dNTP、DNA聚合酶、內控對照都包含在PCR預混液（Mix）乾粉中。用途：檢測細胞培養及生物製品的支原體汙染建議適用範圍
  • 方法：珍貴細胞株被支原體汙染怎麼祛除？
    非常珍貴的細胞或不易獲得的生物樣本，被支原體汙染了，但需要挽救，不能丟棄， 例如：珍稀的細胞種子。可採用支原體徹底清除法。本文締一生物為您分析珍貴細胞株被支原體汙染怎麼祛除？方法:珍貴細胞株被支原體汙染怎麼祛除？