細胞培養出現支原體汙染的危害及檢驗方法

2020-11-12 締一0601

支原體是目前已知一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小的原核細胞型微生物。

細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體汙染是個世界性問題。國內外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和菜氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國外調查證明，大約有二十多種支原體能汙染細胞，有的細胞株可以同時汙染兩種以上的支原體。支原體汙染的來源包括工作環境的汙染、操作者本身的汙染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養基的汙染、被汙染細胞造成的交叉汙染、實驗器材的汙染、製備細胞的原始組織或器官的汙染，等等。

因而培養細胞一旦發生汙染多數將無法挽回。

支原體汙染後，因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存，培養基一般不發生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞受到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長等。組織細胞培養工作中，可以從以下幾方面來預防支原體的汙染：控制環境汙染；嚴格實驗操作；細胞培養基和器材要保證無菌；在細胞培養基衝加入適量的抗生素。

那麼如何能夠快速準確的檢驗出我們的細胞有沒有被支原體汙染呢？

  • 常規PCR法：是根據支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設計引物，對待檢樣本DNA進行擴增，通過對擴增產物的大小分析作出診斷。
  • 優點：
  • ①靈敏度高，特異性好。
  • ②時間短，2-3小時出結果。
  • ③符合歐洲藥典。
  • ④操作簡單。

  • 適用範圍
  • A. 科研用戶，細胞上清的篩查可選用MB公司生產的支原體常規PCR檢測試劑盒（一步法）。（詳見下文） 【Venor® Gem OneStep (貨號:11-8050)】或【Venor® Gem Advance (貨號: 11-7096)】
  • B. 對於需遵循藥典要求的生物製藥企業，可選用MB公司生產的支原體常規PCR檢測試劑盒（經典法）。 【Venor® Gem Classic(貨號: 11-1050) 】+ Taq酶 (貨號: 53-1050)】 或【Venor® Gem Classic (貨號: 11-1050G)】
  • 特點
  • 1. 內控對照已加在預混液中，無需另外配置，使用便捷。
  • 2.高特異性，僅一條陽性對照條帶，即可涵蓋所有可能感染細胞的支原體物種。 操作簡單，易於觀察。
  • 3.高靈敏度，1-5拷貝/μl的支原體DNA即可檢出。
  • 4.歐洲藥典要求的26種支原體均可檢出。該試劑盒可檢測出1種脲原體、7種無膽甾原體和85種支原體。 操作步驟 下列圖示以Venor® Gem OneStep支原體常規PCR檢測試劑盒(一步法)( 貨號：11-8050) 為例，具體產品操作以說明書為準。 第1步：樣本處理

  • 第2步：試劑製備

  • 第3步：PCR體系建立

  • 第4步：啟動PCR反應

  • 第5步：電泳結果分析


  • 儲存條件 2~8℃至少12個月。復溶後必須在-18℃保存。

相關焦點

  • 細胞培養：關於支原體汙染的危害
    支原體汙染普遍存在，據美國數據統計，細胞發生支原體汙染的機率在70%以上。同時，由於支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到，不易被實驗者肉眼發覺，支原體汙染逐漸成為一個普遍存在的問題。本文締一生物為您分析細胞培養：關於支原體汙染的危害。
  • 細胞培養支原體汙染的判斷和處理方法
    ，光鏡下難以看清它的形態結構，並對青黴素有抗藥性，是細胞培養界的隱性殺手。主要來源是血清，支原體汙染不能用肉眼或光學顯微鏡檢查細胞觀察出來，帶有一定的隱蔽性，易被人們忽視。當細胞被支原體汙染後，在光鏡下常可見到細胞核及胞漿內出現大小不等的顆粒或空泡，細胞營養液可能毫無變化，短期內細胞沒有明顯的病理變化，也可以因為傳代或換液而緩解。只有當汙染嚴重時才影響細胞增殖，使細胞脫落。支原體可以與宿主細胞形成一個共生關係，使汙染不斷擴大。
  • 細胞被支原體汙染的危害有多大
    在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體汙染是一個世界性的難題。當細胞（特別是傳代細胞）被支原體汙染後，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般並未發生顯著的影響，因而細胞被支原體汙染一般難以察覺。
  • 分享：一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法
    支原體汙染是細胞培養實驗中的常見問題之一，那如果細胞被支原體汙染不明顯，出現實驗結果難以理解，重複性差等問題如何解決呢，本文締一生物為您分享：一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法。分享：一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法常規PCR
  • 實驗室細胞培養支原體汙染怎麼辦
    概述：在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體汙染是一個世界性的難題。細胞培養中常遇見的有細菌汙染、真菌汙染、支原體汙染、病毒汙染等。說起支原體汙染，估計細胞培養的同學就開始犯愁了，細胞培養的老手都知道，支原體汙染非常不易察覺。
  • 細胞培養中的支原體汙染的預防及處理
    國外調查證明，大約有二十多種支原體能汙染細胞，有的細胞株可以同時汙染兩種以上的支原體。 支原體汙染的來源包括工作環境的汙染、操作者本身的汙染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養基的汙染、被汙染細胞造成的交叉汙染、實驗器材的汙染、製備細胞的原始組織或器官的汙染，等等。
  • 細胞培養中的支原體汙染問題
    支原體無細胞壁形態呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態多變，在光境下不易看清部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構．其中央有電幹密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在於細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。
  • 祛除細胞培養中支原體的方法
    對於費力擴增的細胞（如已轉染，或經過體外刺激），如果細胞中發現有支原體汙染， 但此細胞又不願丟棄，希望繼續培養， 推薦使用MB公司生產的專利複合抗生素Zell Shield®（支原體祛除劑）。②在祛除細胞支原體汙染的過程中，需要環境、試劑及耗材確保潔淨，無新的支原體汙染加入。只要如法操作，在使用Zell Shield®四代後，細胞中的支原體即可祛除。特點1) 高效廣譜。Zell Shield®通過阻止支原體、真菌、黴菌、致命病菌增殖過程中DNA及蛋白的合成，有效抑制上述微生物的增殖。
  • 細胞培養的實驗室對支原體汙染預防有幾種預防
    支原體的汙染肉眼不易察覺，直到嚴重的階段才會出現培養基變色、細胞異常等情況。支原體可造成細胞代謝改變，基因表達譜發生變化，從而嚴重幹擾實驗進程。本文締一生物為您分析細胞培養的實驗室對支原體汙染預防有幾種預防。因此，在細胞培養過程中，定期監測是否存在支原體汙染，及時預防支原體汙染是每個科研人員的工作之一。
  • 細胞總培養不好，你考慮過是支原體在作亂嗎
    ，則高度提示：細胞可能出現了支原體汙染。據報導，細胞培養中發生支原體汙染的機率較高，會達到70%左右，常規抗生素的使用對支原體幾乎無效。那麼，支原體汙染，對細胞培養有什麼危害呢？大量支原體聚集在真核細胞表面（掃描電鏡照片）細胞被支原體汙染，解決方案：方法一：確認細胞已被支原體汙染，終止試驗，丟棄所有被汙染的細胞和耗材。
  • 細胞中支原體的汙染檢測有如下幾種方法
    支原體最早發現於1898年，1956年Robinson等首次從細胞培養物中分離出支原體，之後國內外關於支原體汙染細胞的報導屢見不鮮。它廣泛存在於自然界中，有100餘種。現在只要是做細胞培養並發表論文，國際期刊就要求一定要做支原體檢測。一般要一周測一次支原體。
  • 檢測細胞培養及生物製品的支原體汙染選用什麼呢
    支原體檢測試劑盒Venor®GeM OneStep採用常規PCR方法，並包含PCR需要的所有試劑。其中引物和dNTP、DNA聚合酶、內控對照都包含在PCR預混液（Mix）乾粉中。重懸緩衝液復溶Mix乾粉，分裝到PCR管中，分別加入細胞上清（陰性對照）、復溶的陽性對照DNA和待測樣品（細胞上清或提取的樣本DNA），進行PCR反應。
  • 支原體汙染引發細胞應激狀態的一則報導
    支原體寄生於人、動物、植物、昆蟲細胞，為寄生生活。 支原體容易附著於細胞表面，與宿主細胞胞膜融合併交換成分。 支原體無論是對於科研或臨床用的培養細胞，還是對於工業上的生產細胞，都會產生嚴重的危害，例如導致細胞基因表達譜改變，但更多具體的改變並不清楚。
  • 勿讓支原體成為培養細胞的殺手
    有時看到論文裡，會寫到在培養細胞時，一周檢測一次支原體，為什麼會出現這種情況呢？原來，支原體很容易成為培養細胞的殺手。支原體直徑約0.1-0.3µm，比細菌還小。它容易附著於細胞表面，與宿主細胞胞膜融合併交換成分。環境中很容易存在支原體，人體也容易攜帶支原體。
  • Nature:大量的細胞研究被支原體汙染摧毀
    支原體汙染是細胞培養中普遍存在的一種臭名昭著的汙染源。支原體的存在會剝奪細胞的營養物質，改變某些基因的表達水平，從而對細胞生物學的研究產生深遠的影響。支原體是最小的可體外生長的微生物，直徑約為0.3～0.8um，它們可以通過濾菌器而無法被過濾除去。
  • 同樣是細胞被支原體汙染，怎麼挑選支原體祛除劑
    養細胞時，除了支原體的檢測需要定期進行外，支原體的預防和祛除也是一個重要方面。它包括工作區域中的支原體的預防和祛除和培養箱水槽、水浴鍋中預防支原體的汙染。但一旦發生細胞培養時有支原體汙染，應如何挑選支原體祛除劑呢？這裡指的支原體祛除劑，是加入到細胞培養基中來發揮作用。德國MB有三種支原體祛除劑，都是加入到細胞培養基中使用。它包括：1.
  • 如何有效把支原體汙染趕出你的細胞?
    對於已耗費很多時間、大量擴增起來的細胞，或經過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞，如果發現細胞被支原體汙染了，怎麼辦？本文締一生物為您分析如何有效把支原體汙染趕出你的細胞？ 由於前期工作量巨大，我們無法丟棄已有細胞。
  • 細胞培養汙染拯救及預防方法
    （一）汙染的類型§細胞培養過程中的汙染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養環境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質，包括生物和化學物質。1、細菌汙染§細菌汙染是實驗室細胞培養中常見的汙染，即使在細胞培養液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起汙染。
  • 細胞實驗重複性差?先看看有沒有支原體汙染
    全世界範圍內，不同實驗室的科研人員在培養細胞時，發生支原體汙染的概率是10%-85%不等。支原體是最小的原核生物，大約0.2-0.3um, 可以透過濾膜(0.22-0.45 um)，因此被汙染細胞常常肉眼觀察不到。
  • 細胞培養中支原體檢測的重要性
    支原體是細胞外生存的最小微生物，是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.2~0.5um之間，呈高度多形性，有球形、杆形、絲形、分枝狀等多種態。 1、支原體存在於我們周圍，他可能就如塵埃一樣存在於我們的環境中 2、可透過一般的濾膜，所以不要寄希望於過濾可以清楚支原體汙染的液體 支原體對培養細胞的汙染發生率高，據估計平均發生率在60%左右。同時又非常隱秘，早期不容易被發現，除非用特異性和靈敏度都非常高的檢測試劑盒。