Nature:大量的細胞研究被支原體汙染摧毀

2021-01-15 先達基因

支原體汙染是細胞培養中普遍存在的一種臭名昭著的汙染源。支原體的存在會剝奪細胞的營養物質,改變某些基因的表達水平,從而對細胞生物學的研究產生深遠的影響。支原體是最小的可體外生長的微生物,直徑約為0.3~0.8um,它們可以通過濾菌器而無法被過濾除去。又因為其缺乏細胞壁,所以常規的抗生素並不能對它們起到抵抗作用。由於支原體本身的特性,不易被清除,而導致實驗研究中資金和人力的極大損失。

賓西法尼大學的研究者John Hogenesch和Anthony Olarerin-George發現,支原體汙染遠比我們想像的更加嚴重和普遍,這篇新聞《支原體毀了多少細胞研究》發表在2014年7月29日的《Nature》,再次引發了細胞學科研工作者對於支原體汙染的關注。

John Hogenesch每次看到自己的實驗員愁眉不展時,他立馬就知道是實驗出問題了,他會給與實驗員一個好的方法去查找失敗的原因——「檢查下細胞培養是否存在支原體汙染」。

支原體汙染總是會影響研究的發現,並浪費大量的科研經費。John Hogenesch的實驗室去年就遭遇了一次支原體汙染,雖然很快解決了問題,但還是損失了大約100,000美元和一年的研究時間。支原體汙染除了來源於其他汙染的細胞外,大多數是來自於實驗室操作人員,很多支原體在人體是正常菌群,稍有不慎就可能帶入實驗室而汙染細胞。支原體再生很快,它不像其他的微生物會使得培養基變得渾濁,它的存在不會產生任何可視的特徵。

支原體是一個長期存在的問題。1956年,約翰霍普金斯的研究者報導了其實驗室中的Hela細胞存在支原體汙染,而Hela細胞作為一種人宮頸癌細胞被廣泛地用於各個研究領域。20世紀90年代初,美國食品和藥物管理局檢測了超過20,000例細胞培養,結果發現超過15%的細胞培養存在支原體汙染。1991年,阿根廷的一項研究表明,200個細胞樣本中汙染了支原體的細胞超過70%。特別是最近,2002年來自德國DSMZ(國家菌種保藏中心)的研究表明,440種細胞系(大多是白血病淋巴瘤細胞)中存在28%的比例被支原體汙染。以上研究數據表明支原體存在已久,並且持續存在不容忽視。

為了全面地了解支原體汙染的情況,獲得公平的評估數據,John Hogenesch和Anthony Olarerin-George進行了廣泛的樣本分析,他們分析的樣本序列數據來自於NCBI的高通量測序資料庫(SRA)中的項目,主要是2012年-2013年進行的實驗項目,包括嚙齒類動物樣本和靈長類動物樣本共計9395種。通過對這些樣本細胞進行基因表達水平的研究,尋找支原體DNA,結果發現11%的樣本都存在有支原體汙染。

Hogenesch告訴我們,樣本分析中,支原體存在水平較高的研究項目的成果還曾見刊於一些領先的雜誌,包括細胞(Cell)、自然(Nature)和美國科學院院報(Proceedings of the National Academy of Sciences)等。雖然支原體汙染的存在並不能說明這些研究發現是無效,但是這種細菌卻可以影響數百個基因的表達水平,並且通過與細胞競爭營養物質而阻礙細胞的生長。此外,在一組感染了支原體的淋巴瘤細胞中,Hogenesch和Olarerin-George發現並鑑定了61個被支原體所改變的基因。目前,這些工作的可以在 BioRxiv 生物預印本網站上看到,並且他們計劃很快將他們的發現提交給同行評審期刊。Hogenesch說,如果查過十分之一的細胞被汙染的話,重複實驗和更換細胞所花費的時間和資源將會導致數億美元的損失。

Hans Drexler,來自德國菌種保藏中心的臨床科學家認為,支原體汙染是「草率操作」的結果,支原體是不會憑空出現的,它們都是被人帶入細胞培養中。對於如此多的細胞存在汙染,他並不感到驚訝。在2010-2013年間他的實驗室收到的人急性白血病和淋巴瘤細胞中約有10%存在有支原體汙染,相比較於20世紀90年代初的感染率25%來說已經算是一種進步。

Drexler認為,支原體的持續存在是由於細胞研究中的「黑市交易」,研究者們總是隨意地共享細胞培養液。他估計通過這種來源獲得的細胞中10%的存在支原體汙染,而官方供應商提供的細胞則不存在支原體汙染。為了解決這個問題,Drexler建議實驗室可以多花些錢從信譽良好的銷售渠道那購買細胞系,並且對已有的細胞系進行支原體的檢測。

目前,對於支原體汙染的檢測,先達基因(gendx)的支原體檢測試劑盒,每次檢測只需半個小時,減少了很多工作量,其原理是基於其自主研發的恆溫核酸檢測技術(ERA),結合恆溫螢光定量檢測儀,可以在恆定的低溫下(25℃-42℃)對痕量的支原體種內保守性DNA片段進行特異性的擴增,擴增反應可以在20min內完成,該試劑盒檢測範圍涵蓋130種支原體。

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    在細胞培養過程中,支原體感染發生率達到63%,因而細胞培養過程中被支原體汙染是一個世界性的難題。當細胞(特別是傳代細胞)被支原體汙染後,細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變,而細胞的生長率一般並未發生顯著的影響,因而細胞被支原體汙染一般難以察覺。
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    國內外研究表明,95%以上是以下四種支原體:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(國外調查證明,大約有二十多種支原體能汙染細胞,有的細胞株可以同時汙染兩種以上的支原體。 支原體汙染的來源包括工作環境的汙染、操作者本身的汙染(某些支原體在人體是正常菌群)、培養基的汙染、被汙染細胞造成的交叉汙染、實驗器材的汙染、製備細胞的原始組織或器官的汙染,等等。
  • 支原體汙染引發細胞應激狀態的一則報導
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  • 細胞培養:關於支原體汙染的危害
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  • 實驗室細胞培養支原體汙染怎麼辦
    概述:在細胞培養過程中,支原體感染發生率達到63%,因而細胞培養過程中被支原體汙染是一個世界性的難題。細胞培養中常遇見的有細菌汙染、真菌汙染、支原體汙染、病毒汙染等。說起支原體汙染,估計細胞培養的同學就開始犯愁了,細胞培養的老手都知道,支原體汙染非常不易察覺。
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  • 細胞培養出現支原體汙染的危害及檢驗方法
    支原體是目前已知一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小的原核細胞型微生物。細胞培養(特別是傳代細胞)被支原體汙染是個世界性問題。國內外研究表明,95%以上是以下四種支原體:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和菜氏無膽甾原體(A.laidlawii),為牛源性。國外調查證明,大約有二十多種支原體能汙染細胞,有的細胞株可以同時汙染兩種以上的支原體。
  • 細胞培養中的支原體汙染問題
    支原體無細胞壁形態呈高度多形性.可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態多變,在光境下不易看清部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構.其中央有電幹密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在於細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似,但微絨毛電子密度比支原體小,且中央無顆粒群或中央束。
  • 細胞培養支原體汙染的判斷和處理方法
    ,光鏡下難以看清它的形態結構,並對青黴素有抗藥性,是細胞培養界的隱性殺手。主要來源是血清,支原體汙染不能用肉眼或光學顯微鏡檢查細胞觀察出來,帶有一定的隱蔽性,易被人們忽視。當細胞被支原體汙染後,在光鏡下常可見到細胞核及胞漿內出現大小不等的顆粒或空泡,細胞營養液可能毫無變化,短期內細胞沒有明顯的病理變化,也可以因為傳代或換液而緩解。只有當汙染嚴重時才影響細胞增殖,使細胞脫落。支原體可以與宿主細胞形成一個共生關係,使汙染不斷擴大。
  • 哪些情況下細胞會被支原體汙染,紫外照射不一定能殺滅支原體
    細胞株若受到細菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之汙染時,會嚴重的影響實驗的結果。本文威正翔禹/締一生物為您分析細胞支原體汙染之一般情況。但是若受到支原體之汙染時,細胞之外觀較無明顯變化,但是其汙染會造成細胞之生長速率緩慢、細胞產生病變之型態改變等等變化。
  • 細胞被支原體汙染是每個實驗室常見但不自知的事
    在此之前強調一下我的相關研究是有關衣原體的,而不是支原體。每次聽到別人問我,你的支原體做的怎麼樣的時候,雖然我嘴巴上給你解釋我做的是衣原體,但是我的內心是一萬隻草泥馬奔過的。所以看過這個分享的人要是再問我你做的支原體怎麼樣,我。。。。。。   這周主要講有關支原體汙染細胞的原因和樣子。
  • 支原體汙染的影響是什麼?如何應對呢?
    因此,被支原體汙染的細胞會持續受到影響,導致實驗數據不準確。支原體汙染不僅是細胞培養中需要克服的現象,而且是製藥、生物製品生產中需要加以避免的。支原體汙染的影響是什麼?細胞被支原體汙染,解決方案方法一:確認細胞已被支原體汙染,終止試驗,丟棄所有被汙染的細胞和耗材。重新復甦細胞,注意選用未被汙染的細胞株、血清和培養基,並規範操作。方法二:對於珍貴的,樣品不可再得的細胞,或價格昂貴的種子細胞,不但無法丟棄,而且作為種子細胞,還需要徹底根除支原體汙染。
  • 細胞培養的實驗室對支原體汙染預防有幾種預防
    支原體的汙染肉眼不易察覺,直到嚴重的階段才會出現培養基變色、細胞異常等情況。支原體可造成細胞代謝改變,基因表達譜發生變化,從而嚴重幹擾實驗進程。本文締一生物為您分析細胞培養的實驗室對支原體汙染預防有幾種預防。因此,在細胞培養過程中,定期監測是否存在支原體汙染,及時預防支原體汙染是每個科研人員的工作之一。
  • 分享:一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法
    支原體汙染是細胞培養實驗中的常見問題之一,那如果細胞被支原體汙染不明顯,出現實驗結果難以理解,重複性差等問題如何解決呢,本文締一生物為您分享:一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法。分享:一種在細胞培養中支原體汙染檢測的方法常規PCR
  • 細胞中支原體的汙染檢測有如下幾種方法
    支原體最早發現於1898年,1956年Robinson等首次從細胞培養物中分離出支原體,之後國內外關於支原體汙染細胞的報導屢見不鮮。它廣泛存在於自然界中,有100餘種。現在只要是做細胞培養並發表論文,國際期刊就要求一定要做支原體檢測。一般要一周測一次支原體。
  • 如何給細胞做支原體篩查?
    細胞培養是實驗室的常規操作和科研基礎。其中,保證細胞不受支原體的汙染是決定實驗成敗的重要環節。然而,支原體汙染細胞的發生率又非常高,有報導高達63%。那麼,這些支原體汙染是從哪裡來的呢?一瓶被支原體汙染的細胞足以威脅到其他培養的細胞。因此,定期對細胞培養基、細胞培養上清進行支原體的監測是非常重要的。
  • 勿讓支原體成為培養細胞的殺手
    有時看到論文裡,會寫到在培養細胞時,一周檢測一次支原體,為什麼會出現這種情況呢?原來,支原體很容易成為培養細胞的殺手。支原體直徑約0.1-0.3µm,比細菌還小。它容易附著於細胞表面,與宿主細胞胞膜融合併交換成分。環境中很容易存在支原體,人體也容易攜帶支原體。
  • 不可小看支原體汙染問題
    在培養細胞時,人們常常關注細菌和真菌的汙染,認為它們是細胞培養的主要幹擾因素。但其實,更嚴重的是支原體 的感染,它的發生率非常高,而且不易被發現。不僅普通光鏡下無法發現支原體,而且培養基也不容易變色。只有在汙染的後期培養基才容易變黃。下圖為支原體嚴重汙染後的表現:那麼,支原體汙染為什麼發生率這麼高?