支原體汙染是細胞培養中普遍存在的一種臭名昭著的汙染源。支原體的存在會剝奪細胞的營養物質,改變某些基因的表達水平,從而對細胞生物學的研究產生深遠的影響。支原體是最小的可體外生長的微生物,直徑約為0.3~0.8um,它們可以通過濾菌器而無法被過濾除去。又因為其缺乏細胞壁,所以常規的抗生素並不能對它們起到抵抗作用。由於支原體本身的特性,不易被清除,而導致實驗研究中資金和人力的極大損失。
賓西法尼大學的研究者John Hogenesch和Anthony Olarerin-George發現,支原體汙染遠比我們想像的更加嚴重和普遍,這篇新聞《支原體毀了多少細胞研究》發表在2014年7月29日的《Nature》,再次引發了細胞學科研工作者對於支原體汙染的關注。
John Hogenesch每次看到自己的實驗員愁眉不展時,他立馬就知道是實驗出問題了,他會給與實驗員一個好的方法去查找失敗的原因——「檢查下細胞培養是否存在支原體汙染」。
支原體汙染總是會影響研究的發現,並浪費大量的科研經費。John Hogenesch的實驗室去年就遭遇了一次支原體汙染,雖然很快解決了問題,但還是損失了大約100,000美元和一年的研究時間。支原體汙染除了來源於其他汙染的細胞外,大多數是來自於實驗室操作人員,很多支原體在人體是正常菌群,稍有不慎就可能帶入實驗室而汙染細胞。支原體再生很快,它不像其他的微生物會使得培養基變得渾濁,它的存在不會產生任何可視的特徵。
支原體是一個長期存在的問題。1956年,約翰霍普金斯的研究者報導了其實驗室中的Hela細胞存在支原體汙染,而Hela細胞作為一種人宮頸癌細胞被廣泛地用於各個研究領域。20世紀90年代初,美國食品和藥物管理局檢測了超過20,000例細胞培養,結果發現超過15%的細胞培養存在支原體汙染。1991年,阿根廷的一項研究表明,200個細胞樣本中汙染了支原體的細胞超過70%。特別是最近,2002年來自德國DSMZ(國家菌種保藏中心)的研究表明,440種細胞系(大多是白血病淋巴瘤細胞)中存在28%的比例被支原體汙染。以上研究數據表明支原體存在已久,並且持續存在不容忽視。
為了全面地了解支原體汙染的情況,獲得公平的評估數據,John Hogenesch和Anthony Olarerin-George進行了廣泛的樣本分析,他們分析的樣本序列數據來自於NCBI的高通量測序資料庫(SRA)中的項目,主要是2012年-2013年進行的實驗項目,包括嚙齒類動物樣本和靈長類動物樣本共計9395種。通過對這些樣本細胞進行基因表達水平的研究,尋找支原體DNA,結果發現11%的樣本都存在有支原體汙染。
Hogenesch告訴我們,樣本分析中,支原體存在水平較高的研究項目的成果還曾見刊於一些領先的雜誌,包括細胞(Cell)、自然(Nature)和美國科學院院報(Proceedings of the National Academy of Sciences)等。雖然支原體汙染的存在並不能說明這些研究發現是無效,但是這種細菌卻可以影響數百個基因的表達水平,並且通過與細胞競爭營養物質而阻礙細胞的生長。此外,在一組感染了支原體的淋巴瘤細胞中,Hogenesch和Olarerin-George發現並鑑定了61個被支原體所改變的基因。目前,這些工作的可以在 BioRxiv 生物預印本網站上看到,並且他們計劃很快將他們的發現提交給同行評審期刊。Hogenesch說,如果查過十分之一的細胞被汙染的話,重複實驗和更換細胞所花費的時間和資源將會導致數億美元的損失。
Hans Drexler,來自德國菌種保藏中心的臨床科學家認為,支原體汙染是「草率操作」的結果,支原體是不會憑空出現的,它們都是被人帶入細胞培養中。對於如此多的細胞存在汙染,他並不感到驚訝。在2010-2013年間他的實驗室收到的人急性白血病和淋巴瘤細胞中約有10%存在有支原體汙染,相比較於20世紀90年代初的感染率25%來說已經算是一種進步。
Drexler認為,支原體的持續存在是由於細胞研究中的「黑市交易」,研究者們總是隨意地共享細胞培養液。他估計通過這種來源獲得的細胞中10%的存在支原體汙染,而官方供應商提供的細胞則不存在支原體汙染。為了解決這個問題,Drexler建議實驗室可以多花些錢從信譽良好的銷售渠道那購買細胞系,並且對已有的細胞系進行支原體的檢測。
目前,對於支原體汙染的檢測,先達基因(gendx)的支原體檢測試劑盒,每次檢測只需半個小時,減少了很多工作量,其原理是基於其自主研發的恆溫核酸檢測技術(ERA),結合恆溫螢光定量檢測儀,可以在恆定的低溫下(25℃-42℃)對痕量的支原體種內保守性DNA片段進行特異性的擴增,擴增反應可以在20min內完成,該試劑盒檢測範圍涵蓋130種支原體。