利用CRISPRa誘導性報告基因從條形碼群體中分離活細胞克隆

一個基因組可以編碼數百種不同的細胞類型多種功能，這是所有複雜生物的基礎。最近，單細胞研究發現細胞具有不同程度的異質性，甚至在克隆細胞群中。亞克隆群體的形成和進化選擇塑造了重要生物學過程，從生命體發育，組織分化和細胞重編程到疾病的發展和治療抵抗。傳統譜系示蹤法可以用來繪製細胞群體的異質性進化選擇之前和之後，但無法將早期初始克隆與他們的相應選擇後進行功能研究。

在臨床中黑色素瘤患者常對RAFi產生耐藥性。耐藥性在多大程度上反映了是預先存在的抗性克隆還是抗性獲得仍有爭議。

我們用CaTCH來研究亞克隆在體內靶向治療期間的進化，發現RAFi/MEKi耐藥很大程度上不是由於選擇了預先存在的抗性克隆，而是大多數複製人都能達到獲得性的抗性克隆。

CaTCH工作流：a利用dCas9VPR結構和條形碼（BC）報告器基因轉導後，對部分細胞進行了篩選實驗，以識別細胞具有所需表型的克隆。克隆的特定條形碼序列由NGS識別並用於設計互補的sgRNA結構。sgRNAs被轉化為保留的、未選擇的群體，並特別引導dCas9 VPR到感興趣的條形碼以激活GFP表達式。GFP陽性克隆可通過流式細胞儀（FACS）活體分離並用於功能研究。