2019年9月30日訊/生物谷BIOON/---基因組編輯可以誘導包括易位在內的染色體重排。儘管測序方法已用於鑑定和描述與遺傳疾病和基因編輯有關的染色體異常，但是染色體重排的時間動態變化鮮為人知。
之前的研究依賴於使用基因組整合的LacO/TetO陣列，這既枯燥又有挑戰性。與螢光蛋白融合在一起的沒有核酸酶活性的dCas9，或者招募單向導RNA（sgRNA）的與螢光蛋白融合在一起的RNA結合蛋白能夠對基因組位點進行CRISPR介導的實時成像。但是，對編碼CRISPR組件的DNA的需要限制了它的使用。傳統的螢光原位雜交（FISH）需要DNA變性，同時在體外與sgRNA組裝在一起的螢光標記dCas9（CASFISH）僅檢測固定樣本中的基因組位點，這就限制了實時追蹤。
在一項新的研究中，來自美國史丹福大學、卡斯迪加學校和中國浙江大學的研究人員報導了一種稱為CRISPR活細胞螢光原位雜交（CRISPR live-cell fluorescent in situ hybridization, CRISPR LiveFISH）的實時成像方法，從而允許研究活細胞中的各種染色體功能。相關研究結果發表在2019年9月20日的Science期刊上，論文標題為「CRISPR-mediated live imaging of genome editing and transcription」。
這些研究人員首次將等摩爾含量的蛋白dCas9-EGFP（即與增強型綠色螢光蛋白融合在一起的dCas9）和經過Cy3標記的嚮導RNA（gRNA）組裝成螢光核糖核蛋白（fRNP），所組裝而成的fRNP靶向3號染色體（Chr3）中的一個重複序列區域（Chr3q29，大約500次重複）。他們通過電穿孔將fRNP遞送到人骨肉瘤U2OS細胞中。流式細胞儀分析表明95%以上的gRNA信號在轉染之後的4小時內受到降解，這與之前報導的gRNA在細胞環境中高度不穩定相一致。然而，他們觀察到Cy3-gRNA對這個Chr3位點（即Chr3q29）的快速且持久的標記，這表明穩定的與靶標結合在一起的dCas9-gRNA複合物形成了。Cy3-gRNA的信噪比（signal-to-background ratio, S/B）比dCas9-EGFP的S/B高4倍以上。與經常在核仁中聚集的dCas9-EGFP不同的是，Cy3-gRNA並不在核仁中聚集。通過進行體外測定，他們發現過量的靶DNA而不是非靶DNA，保護Cas9:gRNA:DNA三元複合物中的Cy3-gRNA免受核糖核酸酶A降解。此外，相比於存在不小於6個鹼基對（bp）錯配的靶DNA，結合著dCas9的Cy3-gRNA更好地受到完全匹配的靶DNA或者在PAM（protospacer adjacent motif, 前間隔序列鄰近基序）遠端存在不大於4bp錯配的靶DNA的保護。
圖片來自Science, 2019, doi:10.1126/science.aax7852。
基於這種靶DNA依賴性的gRNA保護，這些研究人員開發出CRISPR LiveFISH，即一種部署與dCas9組裝在一起的螢光gRNA探針來靶向和標記活細胞中基因組序列的方法。他們在來自巴陶症候群（Patau Syndrome）患者的細胞中測試了這種方法，其中巴陶症候群是一種13號染色體（Chr13）三體遺傳病，它導致器官缺陷、智能障礙和身體缺陷，並且最終是致命性的。他們將含有dCas9和Atto565標記的gRNA（Atto565-gRNA）且靶向Chr13上的一個重複序列區域（Chr13q34，大約350次重複）的fRNP轉染到正常的或者源自患者的產前羊水細胞中，並檢測到Atto565-gRNA快速且穩健地標記Chr13，這優於dCas9-EGFP RNP標記或基於質粒的成像。CRISPR LiveFISH的高效率可通過核型分析進行定量，它的準確性可通過核型分析進行證實。簡單地共遞送經過不同的螢光團標記的fRNP能夠同時地可視化觀察U2OS細胞和人原代T細胞中的Chr3重複序列區域和Chr13重複序列區域。之前利用正交dCas9或將sgRNA與RNA適配體（RNA aptamer）和RNA結合蛋白偶聯在一起的方法需要多個構造體。
這些研究人員隨後利用CRISPR LiveFISH來研究CRISPR-Cas9在活細胞中誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）的實時動態變化。他們構建出穩定地表達與螢光Apple蛋白融合在一起的截斷53BP1蛋白（aa1220-1711）的U2OS細胞系（以下稱為U2OS-53BP1-Apple細胞），其中53BP1蛋白是一種得到很好描述的DNA DSB傳感蛋白。人類基因組含有通常與大多數蛋白編碼基因（>60%）相鄰的重複序列（<100kb）。他們通過核轉染方法將切割Chr3中PPP1R2基因的基因編輯RNP（Cas9/gPPP1R2）和對Chr3q29重複序列區域進行標記的CRISPR LiveFISH fRNP（Cas9/A488-gChr3）共遞送到U2OS-53BP1-Apple細胞中，其中Chr3q29重複序列區域與PPP1R2切割位點相距36kb。為了避免fRNP介導的DNA切割，他們針對成像gRNA使用了一個短的間隔序列，這不足以進行DNA切割。在轉染後不久，他們很快就觀察到在含有基因編輯gRNA的細胞中，較高比例的Chr3q29位點與53BP1位點共定位在一起，這表明在PPP1R2位點上快速形成了Cas9誘導的DSB。按序遞送成像fRNP和基因編輯RNP能夠讓他們隨著時間的推移追蹤單個位點上的DSA形成和53BP1招募過程。在遞送基因編輯RNP之後，他們連續數小時地捕捉到53BP1位點快速地和正在招募到53BP1位點。
這些研究人員能夠追蹤基因編輯事件的動態變化。比如，他們觀察到53BP1位點招募Chr3q29位點，隨後與Chr3q29位點脫離開來，這可能表明成功修復了DNA DSB。他們還在很多細胞的單個DNA位點上觀察到53BP1位點的重複招募和脫離，這表明對靶DNA重複進行切割和修復。最終，在將基因編輯RNP遞送到一些細胞之後，多個Chr3q29位點簇集在相同的53BP1位點內，這表明正如之前報導的那樣，在DNA DSB位點之間發生同源配對。最初在單獨的Chr3q29位點上形成的兩個53BP1小體快速地融合在一起，相應地這些同源的Chr3q29位點在融合的53BP1小體內相互作用，這表明53BP1小體融合可能促進同源DSB位點配對。
利用CRISPR對多個基因進行編輯對基因療法比較重要，但是這能夠引入有害的非同源染色體重排。為了可視化觀察染色體易位，這些研究人員共遞送靶向Chr3中PPP1R2和Chr13中SPACA7的基因編輯RNP和CRISPR LiveFISH fRNP來追蹤Chr3q29和Chr13q34（與SPACA7切割位點相距82kb）。在通常是非整倍體的U2OS細胞中，53BP1免疫染色證實了DSB在靶位點上形成。他們能夠觀察到Chr3q29位點和Chr13q34位點之間的配對。這兩個位點顯示了幾乎相同的運動軌跡，而且它們之間的距離幾乎保持恆定，這表明這兩個位點之間可能物理連接。他們追蹤了這些染色體易位的動態變化。Chr3q29和Chr13q34最初是分開的，隨後彼此靠近，並且在很長一段時間內保持在一起，這可能代表著內源性非同源染色體易位。他們還捕捉瞬時事件，在這些瞬時事件中，Chr3q29位點和Chr13q34位點短暫地一起移動並分離開來。為了獨立地證實染色體易位，他們進行發生易位的染色體片段進行克隆、測序和驗證。
這些研究人員進一步擴展了CRISPR LiveFISH，以便實時地對DNA和RNA進行成像觀察。他們利用催化失活的Cas13d（CasRx）--- dCas13d---和人工合成的螢光標記gRNA進行靶RNA成像觀察。U2OS 2-6-3細胞系攜帶一個位於強力黴素（Dox）誘導性基因盒上遊的LacO重複序列陣列，其中這種基因盒含有MS2重複序列陣列。為了同時可視化觀察DNA和RNA，他們設計了Atto488標記的靶向LacO DNA的Cas9 gRNA（下稱gLacO），設計了Atto647標記的靶向MS2 RNA的Cas13d gRNA（下稱gMS2）。通過共遞送gMS2和dCas9/gLacO到表達dCas13d的U2OS 2-6-3細胞中，他們成功地在Dox的存在下對DNA位點和RNA轉錄本進行標記。CRISPR LiveFISH也能夠讓他們追蹤活細胞中RNA轉錄的實時動態變化。在利用高濃度Dox誘導轉錄後，他們在一段時間內觀察到MS2轉錄本在LacO位點附近主逐漸地聚集。
終上所述，這些研究人員報導了用於活細胞DNA和RNA成像的CRISPR LiveFISH技術。化學合成的螢光gRNA與dCas蛋白形成的複合物能夠促進快速穩健地、可擴展地對細胞（包括原代細胞）中的基因組DNA進行追蹤和對細胞中的RNA進行成像。在富含核糖核酸酶的環境中，對Cas9:gRNA:DNA三元複合物中gRNA的靶DNA依賴性保護會富集靶信號，同時讓背景噪音最小化。CRISPR LiveFISH也允許對活細胞中內源性基因組位點上發生的CRISPR誘導的基因編輯和易位事件進行動態追蹤。使用dCas9和dCas13系統的雙DNA/RNA CRISPR LiveFISH能夠對相同細胞中的基因組DNA和RNA轉錄本進行實時成像。人們有可能將CRISPR LiveFISH與其他的基因操縱技術（比如，CRISPRi/a、表觀遺傳修飾和CRISPR-GO）結合使用來加深對基因組組裝和細胞核事件的時空動態變化的理解。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Haifeng Wang et al. CRISPR-mediated live imaging of genome editing and transcription. Science, 2019, doi:10.1126/science.aax7852.