論文彙編：多孔微電極陣列聯合光遺傳學在神經科學領域中的應用

多孔微電極陣列應用案例分享第二期

光遺傳學開闢了一個新的讓人激動的研究領域，使研究者可以在高時空解析度下隨心所欲地控制某些特異類型的細胞。小編這期匯總了全球研究人員利用Maestro multiwell-MEA（多孔微電極陣列）系統配合光遺傳刺激（Lumos）系統進行相關研究的四個案例，幫助大家了解光遺傳學與MEA之間可以擦出什麼樣的火花。

案例介紹

自主神經系統：hiPSC衍生交感和副交感神經元協調控制心率

來源：日本產業技術綜合研究所細胞與分子生物技術研究部，2020， Scientific Reports

自主神經系統(ANS)通過去甲腎上腺素能交感神經的興奮作用和膽鹼能副交感神經信號的抑制作用來調節組織的動態平衡和重塑。儘管有許多關於從人多能幹細胞(hPSCs)誘導交感樣神經元的報導，但還沒有一種誘導方法能有效地從hPSCs分化出膽鹼能副交樣感神經元。本文研究者將傳統的神經細胞誘導方法從2步修改為4步誘導出自主神經系統神經元，誘導至36天時，在含有微型隧道的培養板上，可觀察到神經元軸突的分化。在誘導52天後，給予表達ChR2的神經元藍光刺激，跟隨光刺激的時程，在Maestro MEA系統上會檢測到相應時程的神經元放電，證明新方法誘導的神經元已經分化成為具有功能的ANS神經元。

進一步的研究發現，高細胞密度和低神經營養因子可誘導ANS祖細胞分化成為交感樣神經元，相反條件下可以誘導出副交感樣神經元。為了檢驗這兩種ANS神經元是否能對心肌細胞進行精確調控，研究者先將hiPSC來源的心肌細胞種植在Cytoview MEA 6孔板中，再將誘導至13天的交感樣和副交感樣神經元分別與心肌細胞進行共同培養。用藍光或尼古丁刺激表達ChR2的交感樣神經細胞時，心肌搏動頻率顯著增加；而使用尼古丁刺激副交感樣神經細胞時，搏動頻率明顯降低。單獨培養的心肌細胞使用尼古丁刺激時，只有微弱的變化。至此，研究者建立了一種從hPSCs中高度選擇性地誘導交感樣和副交感樣神經元的方法，促進了人ANS神經的建模和研究。

脊髓損傷：利用光遺傳學構建斑馬魚脊髓損傷模型

來源：美國史丹福大學，2017， SfN poster

複雜的脊椎動物神經元的丟失往往伴隨著永久性的功能障礙，所以細胞消融成為潛在的建立脊髓損傷模型的有效方法。現有的人工手刺法，具有極大的限制性——會引入外來損傷，並且重複性差、死亡率高。而光遺傳技術則可以更精確地控制特定細胞消融，模擬脊髓損傷。研究者將光敏感蛋白表達在斑馬魚的外周神經細胞內，使用藍光刺激誘導細胞消融後，在Maestro MEA系統中檢測神經元放電狀態。與傳統人工方法比較，兩種方法中網絡簇放電頻率都有不同程度的降低，而平均放電頻率都有不同程度的升高。這表明了利用光遺傳技術可以成功地建立脊髓損傷模型。該研究為神經元環路的連通性與脊髓損傷病理學的探索提供了一種新的強有力的檢測方法。

用光控制收縮：在培養板上控制有功能的人類神經-肌肉接點

來源：美國加州大學洛杉磯分校，2020，bioRxiv

研究者使用ALS病人來源的iPSC分化成的骨骼肌細胞和運動神經元，建立了神經肌肉接頭體外細胞模型。為了精確控制該細胞模型，他還將ChR2基因轉入運動神經元內表達，使用Lumos對樣本進行藍光刺激，並利用MEA系統記錄所得的電信號。

該結果顯示，藍光刺激可使神經元產生同步放電，說明使用光遺傳學手段對神經肌肉接頭進行精確控制是可行的。研究者分別使用神經-肌肉接頭拮抗劑和特殊的多層共培養方法，均可確定記錄到的電活動是由神經肌肉接頭產生的，而非運動神經元所產生。最後，他將這種模型用於篩選能改善神經肌肉聯接功能的潛在治療藥物。綜上所述，該體外細胞模型的建立，為包括ALS在內的神經肌肉疾病的研究和治療開闢了新方向。

神經毒理：藥物促癲癇風險評估的神經毒理和藥理研究

來源：美國喬治亞理工學院

在體外功能性神經毒理和藥物安全評估方面，嚙齒類動物原代神經元和iPSC衍生神經元已經得到廣泛運用。但是在開展神經網絡自發電活動測試時，相同樣本的不同復孔間或者不同來源的細胞間的定量結果可能會有差別，有些促癲癇物質對神經網絡的自發放電的影響沒有被很好地體現出來。相比之下，誘發實驗使用可控刺激來獲得受控結果，有助於解決孔間一致性問題並加快實驗進展。另外，網絡活動的頻率和強度這兩個方面往往是關聯的。而使用光遺傳刺激就能夠通過控制頻率這個變量來將強度變量獨立出來。

因此，研究者設計了成對刺激實驗，獲得新的誘發檢測參數，可用於癲癇風險評估相關的神經毒理和藥理研究。最後，研究者還嘗試設計某種刺激模式來對應生物學研究中的某個目標，例如使用高頻刺激來模擬癲癇發作時的神經活動。這一應用凸顯了光遺傳刺激的意義。它在精準控制設計上的靈活性，為開展神經元功能及其機理研究等實驗提供了便利。