TIL細胞治療的應用及其研究進展

2021-01-16 南開細胞工程

摘要：TIL細胞治療是一種過繼性（AIT）免疫療法，自1988年發現了至今，已經被應用於多種腫瘤治療研究中，它是一種利用人體的免疫系統，通過增強或恢復抗腫瘤免疫力實現控制和殺傷腫瘤的新的治療模式。它是從腫瘤組織中分離出的浸潤淋巴細胞，大部分是針對腫瘤特異性突變抗原的T細胞，經細胞因子刺激後，擴增培養，再回輸患者體內，以實現免疫細胞治療腫瘤的功能，有著顯著效果。在本綜述中簡要介紹了TIL免疫治療的一些基本概念、流程和相關研究進展，並討論存在的問題和未來的發展方向。

關鍵詞：TIL；細胞治療；腫瘤



TIL（Tumor Infiltrating Lymphocytes，腫瘤浸潤淋巴細胞），是一種從腫瘤組織中分離出的浸潤淋巴細胞，是從腫瘤組織中發現的腫瘤抗原特異性CD4+、CD8+T細胞群。其中，CD8+T細胞具有腫瘤殺傷作用。TIL 在體內的抑瘤作用受 CD4+CD25+Treg的限制[1]，在體外經IL-2的刺激作用後可恢復腫瘤殺傷活性，擴增後可應用於臨床腫瘤的過繼細胞治療。1986 年，Rosenberg 等[2]從荷瘤小鼠腫瘤組織中發現並分離，並將其命名為TIL細胞。TIL細胞製備較為複雜，首先是從病人手術切除中的腫瘤組織中分離出TIL細胞，隨後在體外大量擴增，由於TIL是特異性殺瘤細胞，其比LAK的腫瘤殺傷活性強50-100倍。隨後，Rosenberg團隊將TIL技術應用於黑素色瘤臨床治療，臨床結果顯示接受TIL細胞治療的患者得到12/20的緩解率[3]。由於TIL細胞的本質是患者自身的T細胞，腫瘤的微環境會抑制有殺瘤效應T細胞的作用，因此早期臨床試驗無法檢測到回輸的TIL細胞。隨後研究發現，在TIL細胞回輸之前先對病人進行Treg細胞清除處理，從而大大降低了腫瘤免疫抑制環境對TIL細胞殺瘤作用的影響[4]

TIL的抗腫瘤機制主要包括以下3種途徑:

（1）TIL中的T細胞在TCR和CD28提供的雙刺激信號下轉變為效應T細胞，直接殺傷腫瘤細胞或分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞。

（2）T細胞通過其表面的Fas與腫瘤細胞表面的FasL結合，通過細胞內信號轉導誘導靶細胞凋亡。

（3）在 Ca+存在下，靶細胞表面形成多聚穿孔素「孔道」，通過滲透壓改變或與顆粒酶協同作用，引發靶細胞溶解或凋亡[5]。



目前，TIL的培養方法依然存在很多技術壁壘。但一般流程是:

(1）在膠原酶的作用下消化成單細胞懸液，消化時間一般為0.5-4ｈ，或４℃過夜。

(2）密度梯度離心液，加入消化好的單細胞懸液，再離心。

(3）使用1000～6000U／ml IL-2進行擴增培養。

Wolf等[6]研究發現，IL-2可刺激TIL中CD4+CD25+Treg的增殖，Treg通過細胞毒T淋巴細胞相關抗原4引發的免疫抑制作用降低了CD8+T 細胞的腫瘤殺傷作用，因此TIL體外快速擴增培養體系扔需進行很大的改進。




首先免疫細胞來源不同，TIL的免疫細胞來自於腫瘤組織，而其他細胞免疫療法大部分來自血液。這直接決定了免疫細胞識別腫瘤的能力。據估計，腫瘤裡分離出的免疫細胞，有60%以上能識別腫瘤，而血液裡面分離的免疫細胞，不到0.5%。

其次，這種新型的療法不是簡單的擴增回輸，而是要確定患者病例中特定的突變，之後利用突變信息找到能夠最有效瞄準這些突變的T細胞，最後提取出專門患者腫瘤中細胞突變的T細胞，這些細胞具有精準識別癌細胞的能力。




圖1  TIL治療流程

如圖1所示：

第一步，獲到病人的腫瘤組織塊，其中混雜著體積較大的腫瘤細胞(淺藍色)以及體積小而圓的T淋巴細胞(紅色，綠色，深藍色);

第二步，將不同種類的T淋巴細胞在細胞板上克隆化，並加入高濃度的IL-2來選擇培養;

第三步，在IL-2的刺激下不同種類的T淋巴細胞都得到了克隆擴增，形成了細胞群;

第四步，用病人的腫瘤細胞和擴增後的T淋巴細胞反應，凡是能夠發生殺瘤效應的T淋巴細胞群作為陽性TIL群留下(紅色)，其餘的丟棄(綠色，深藍色);

第五步，用負載了腫瘤特異性抗原的樹突狀細胞(DC)進一步擴增培養腫瘤特異性的TIL;最後，回輸給預先做了清髓的腫瘤病人。



Pan[7] 等在對 410 例 HCC 患者研究發現，經過 CIK免疫治療的患者總生存率顯著高於單純手術組。接受≥8 周期 CIK 細胞輸注的患者的生存率明顯高於<8 周期組 ，因此CIK細胞輸注術後免疫治療可能是改善肝細胞肝癌患者預後的有效輔助治療方法。此外，Jiang等[8]通過對接受TIL治療的15例HCC術後患者進行14個月的隨訪發現, 所有患者均存活, 僅3例患者復發, 不良反應主要為輕度流感樣症狀, 證明了TIL治療肝癌的安全性和有效性。

這些結果表明，用激活並擴增的自體 TILs 進行免疫治療具有安全性和有效性的特點，因此可以作為肝細胞肝癌患者的新型治療方式。


Ratto [9]等利用 AIT 並結合放射性療法治療 113 例非小細胞肺癌（NSCLC）。對ⅢA期 NSCLC，AIT組總生存期顯著高於常規治療組 (化療加放療)，平均生存期分別為 22 個月和 9.9 個月。對ⅢB期患者，AIT組總生存期顯著高於常規治療組 ，平均生存期分別為23.9個月和7.3個月。Kradin [10]等用 TILs 對 6 例原發性肺腺癌患者進行多次 5.0×108–4.5×109TILs 靜脈輸注或瘤灶內注入，在無白介素-2 和環磷醯胺的情況下，其中 4 例腫瘤消退且患者有較好的耐受性；他們還對常規療法治療無效的轉移性肺癌和轉移性腎細胞癌等7例患者採用特異性 TILs 進行治療，也獲得較好的療效。　



高[11]等人嘗試應用TIL治療了難治復發的B細胞淋巴瘤, 為淋巴瘤的治療提供新方法。

對3例多次化療及美羅華靶向治療後無效的患者, 其中2例為套細胞淋巴瘤, 1例為瀰漫大B細胞淋巴瘤，應用CD3單抗聯合IL-2大量快速擴增TIL，待細胞生長至5×109數量級, 收取細胞, 內毒素及微生物檢測合格後回輸給患者，結果3例患者均能成功大量培養TIL細胞, 培養前以B細胞為主, 培養後TIL細胞CD3+比例達98%以上。TIL中的CD4/CD8細胞比例為1.27/1。化療後3例患者均出現了IV度骨髓移植, 對症處理後均完全恢復。患者平均接受的TIL回輸量為6.3×109, TIL回輸後無明顯不良反應, 3例患者均出現了與靜脈點滴IL-2相關的中度發熱。最早治療的一例套細胞淋巴瘤患者腫瘤完全消失已持續2年2個月, 另外兩例患者腫瘤部分縮小, 已分別持續5個月和2個月。

難治復發淋巴瘤患者的TIL易於擴增。化療預處理後應用TIL治療難治復發淋巴瘤有效率高, 副作用小。





(1) 回輸的TIL無法完全去除Treg，TIL本身存在抑制腫瘤消退的細胞成分，這些起到抑制作用的細胞主要是Treg。

(2) 回輸的TIL經血液循環後存在數量較少。TIL回輸到患者體內經血液循環後僅為原來的0.01% ,這將導致TIL在體外擴增的時間和數量都要延長。

(3) 聯合治療費用昂貴，難以普及。TIL仍然以實驗階段為主，缺乏長期的臨床觀察，對其作用機制、表型、MHC影響等需要進一步研究。

 


TIL自發現後，在一些腫瘤治療中取得了顯著成效，有望成為新型腫瘤生物治療方法。越來越多的研究集中於TIL的分離、培養、擴增及應用，使 TIL研究進展非常迅速。

未來，TIL細胞治療與手術、放化療等傳統治療方法聯合起來。除此之外TIL細胞治療聯合腫瘤疫苗治療將成為新型的治療方案，抗CD25、CTLA-4抗體和抗TNF-α受體的單克隆抗體可靶向清除Treg，解除免疫抑制作用[12]。尋找更多的用於腫瘤免疫治療的分子靶標，開發更多具有增強免疫作用的單克隆抗體。

腫瘤的TIL免疫治療在一些惡性腫瘤中取得了顯著成效，因其靶向性高、特異性強、毒性作用小、療效顯著等優勢已成為一種有效的新型免疫治療方法。同時，TIL免疫治療與放化療在腫瘤治療中起到協同作用。另外，化療除了用於晚期轉移性腫瘤患者的治療，也可治療早期診斷的腫瘤患者。在臨床應用過程中，應根據患者的具體情況來制定治療方案。隨著一些關鍵技術的突破，免疫治療必將成為腫瘤治療的重要組成部分。　



參考文獻：

[1] 陳晚華,劉輝,汪畢,錢其軍.TIL腫瘤過繼細胞治療研究進展[J].中國腫瘤生物治療雜誌,2012,19(06):668-672.

[2]  Rosenberg SA，Spiess P，Lafreniere R． A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lympho-cytes ［J］． Science，1986，233( 4770) : 1318-1319．

[3] Rosenberg A, Packard S, Aebersold M, et al. Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma[J].New Engl J Med, 1988, 319(25): 1676-1680.

[4]  Yao X, Ahmadzadeh M, Lu Y, et al. Levels of peripheral CD4+FoxP3+regulatory T cells are negatively associated with clinical response to adoptive immunotherapy of human cancer[J]. Blood, 2012, 119(24): 5688-5696.

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[8] Jiang SS, Tang Y, Zhang YJ, et al.A phase I clinical trial utilizing autologous tumor-infiltrating lymphocytes in patients with primary hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,  2015, 6 (38) :41339-41349.

[9] Ratto GB, Zino P, Mirabelli S, et al. A randomized trial of adoptive immunotherapy with tumor_x0002_infiltrating lymphocytes and interleukin-2 versus standard therapy in the postoperative treatment of resected nonsmall cell lung cancer. Cancer, 1996, 78(2): 244–251.

[10] Zeng DQ, Yu YF, Ou QY, et al. Prognostic and predictive value of tumor-infiltrating lymphocytes for clinical therapeutic research in patients with non-small cell lung cancer. Oncotarget, 2016, 7(12): 13765–13781.

[11] 高全立,韓露,徐本玲,李玉富. 應用腫瘤浸潤淋巴細胞治療難治復發B細胞淋巴瘤3例報告[A]. 中國免疫學會腫瘤免疫與生物治療分會、中國抗癌協會腫瘤生物治療專業委員會.第十四屆全國腫瘤生物治療大會論文集[C].中國免疫學會腫瘤免疫與生物治療分會、中國抗癌協會腫瘤生物治療專業委員會:中國腫瘤生物治療雜誌編輯部,2015:2.

[12] Golovina TN，Vonderheide RH． Regulatory T cells: Overcoming suppression of T-cell immunity ［J］． Cancer J，2010，16 ( 4 ) :342-347．

來源：馬凱旋｜圖文

老師：陳德富

編輯：李玉   李錦珊

本公號長期徵收稿件

投稿郵箱：nkxibaogongcheng@163.com

指導教師：陳德富

南開大學生命科學學院教授、博士生導師

首屆「談家楨遺傳教育獎」獲得者（2013）

南開大學遺傳學和細胞生物學系主任

南開大學分子遺傳學實驗室PI

南開大學本科生《遺傳學》和《普通生物學》課程負責人

南開大學研究生《現代細胞工程技術》和《分子生物學實驗》課程負責人

天津市科學技術協會委員

天津市生命科學學會聯合體主席團成員、學術諮詢顧問委員會委員

中國遺傳學會常務理事、教學與教育委員會副主任委員、科普專業委員會委員

天津市遺傳學會理事長、支部書記

《遺傳》雜誌優秀編委（2016）

主辦單位：陳德富實驗室
承辦單位：2020生物與醫藥班



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