作者：郭濤 程志鵬
1、研究背景
靜脈血栓形成是世界上致死和致殘的主要疾病之一，在西方國家的發病率約為1/1000。近年荷蘭的一項對近5000例靜脈血栓患者長達8年的隨訪研究顯示，其年病死率為2270/10萬，為正常人群年病死率的4倍。長期以來，國際上認為亞洲人群靜脈血栓的發病率較低。但隨著亞洲地區（特別是中國地區）醫療衛生水平的提升和診療手段的豐富，近年來的研究顯示，靜脈血栓在亞洲地區（特別是中國）的危害愈發顯現。
靜脈血栓是複雜的多基因-環境因素疾病，家系分析以及孿生子研究表明，靜脈血栓形成約有 60%由遺傳因素控制。在歐美國家，已經發現了與歐美人群靜脈血栓形成有關的多種常見遺傳危險因素，其中Factor V Leiden 和 Prothrombin G20210A變異的個體患靜脈血栓形成的風險顯著增加。由於不同民族存在遺傳背景的差異，這兩種多態性在中國人群中非常罕見。以往包括中國在內的亞洲地區並未報導重要的靜脈血栓遺傳危險因素，直到近年來陸續發現了一些重要的中國人群靜脈血栓遺傳危險因素。此次講評的文章即是眾多相關研究中的優秀代表。
2、研究概述
2.1 技術路線
研究者選擇血栓調節蛋白（TM）的編碼基因THBD作為目的基因，從靜脈血栓標本庫中隨機選擇60例組成靜脈血栓組，同時設置正常對照組。針對TH B D基因進行擴增和測序，並對發現的常見基因變異通過酶切進行病例對照分析，一級親屬靜脈血栓形成的相對危險度研究以及該基因變異的功能試驗。
2.2 基因檢測
研究者先剔除了當時巳知的基因變異者和蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗凝血酶（AT）活性低於正常範圍者，然後採用病例-對照研究的方法進行THBD基因重測序研究。在60例靜脈血栓患者中發現了10種THBD基因的變異（1個位於啟動子區域，1個位於5'UTR，5個位於編碼區，3個位於3'UTR)。經分析預測THBDc. —151G>T有可能是與靜脈血栓相關的變異，所有的後續研究均圍繞該突變進行。
首先對該突變在所有病例組和對照組人群中進行基因分型檢測。設計PCR-RFLP分型方法，選取能特異性識別突變位點的MwoI作為限制性內切酶。酶切後的混合物經瓊脂糖凝膠電泳分離，使用紫外凝膠成像系統觀察分型結果。隨機選取96份DNA樣本，用測序的方法與PCR-RFLP方法相比較，判斷分型結果的準確性。結果與限制性酶切分型結果一致，表示PCR-RFLP的分型方法準確可靠。病例對照研究顯示：對於THBDc.—151G>T突變，雜合突變型人群患靜脈血栓的風險是野生型的2.8倍。此外，重測序還發現了5種罕見的致病突變（c.376G>T、c.569C> G、c.635_ 636delinAA、c.659T>G、c.*6_*23del）。合計突變比例為5/108，相對與其他靜脈血栓遺傳因素比例較高。
2.3 蛋白檢測
研究者檢測了血漿中TM的水平。目前尚無方法檢測內皮細胞表面TM的水平，但是血漿存在內皮細胞脫落的TM（即游離TM），選用ELISA的方法檢測其水平。檢測c.—151G>T雜合子以及對應的野生型個體48例。在各分組中，突變雜合子游離TM的平均水平均顯著低於野生型個體游離TM的平均水平。
2.4 家系研究
在分析一級親屬靜脈血栓形成的相對危險度時，為了防止選擇偏倚，研究者僅分析了先證者的一級親屬，而沒有納入先證者。總共176例成員加入研究，收集每例成員的血液標本進行血漿AT、PC、PS活性檢測以及PROC、PROS1、SER-PINC1、THBD突變分析。在研究的176例一級親屬中有81例為突變雜合子，其中1例同時伴有PROC c. 574_576del多態性；另外95例為野生基因型，其中1例同時伴有PS缺乏症。這些親屬共有16人次靜脈血栓事件，其中7例為無誘因靜脈血栓形成棳例存在獲得性危險因素。一級親屬中，雜合子組年靜脈血栓發病率為3.41/1 000，顯著高於野生型組0.94/1 000，雜合突變對靜脈血栓的相對危險度為3.42。
2.5 功能研究
研究者分別轉染的Firefly螢光素酶質粒（F- luc）為 4 種：pGL3-WT、pGL3-MT、pGL3-basic、 pGL3-promoter。pGL3-WT、pGL3-MT 含有野生型和突變型的THB D啟動子區域片段（56 bp）， pGL3-basic不含任何啟動子序列，而pGL3-pro- moter含有SV-40強啟動子序列作為對照。同時共轉染內參照Renilla螢光素酶報告基因（R-luc）。瞬時轉染3種細胞：人臍靜脈內皮細胞、HEK-293細胞、COS-7細胞。結果顯示：與WT啟動子相比，c. 一151G>T突變使3種轉染細胞內螢光素酶報告基因的表達水平均顯著下降。
3、研究價值
3. 1 研究特色
此研究是首批中國人群靜脈血栓常見遺傳危險因素研究之一，雖然所發現的基因變異頻率相對低（微小等位基因頻率小於5%），但對靜脈血栓有著較高的優勢比（OR值2.8），因而在血栓形成中發揮重要作用。這與其他遺傳學研究的發現不同。在目前大多數的遺傳學研究中（例如全基因組關聯分析），多考慮高頻率變異，所發現的有統計學意義的基因變異也為高頻率變異（微小等位基因頻率大於5%甚至10%），但對疾病的優勢比很小（OR多小於1.2），因而在血栓形成中發揮的作用較小，在同時考慮、校正其他的危險因素後往往可忽略不計；同時，這些位點多處於基因的非編碼區甚至基因間隔區，無法在生物學上解釋疾病關聯。因此，低頻率變異在血栓形成中的作用更為重要；同理可推知，對於其他的多基因疾病如糖尿病、冠心病，低頻率變異的研究也更有價值。
3.2 研究意義
血栓性疾病已成為威脅人類生命健康的一類主要疾病，目前全球每年用於血栓性疾病治療的費用高達數百億美元。有關血栓病基因篩查的研究不僅有重大的學術價值，還可望在普通人群中和靜脈血栓家族中開展早期診斷，早期發現攜帶血栓易感基因的人群，從而達到早診斷、早治療的目的，能有效降低此類疾病的發病率、致殘率和致死率。這對於提高我國人民的健康水平、保護社會勞動力將具有重要的意義，因而社會效益巨大。
遺傳學研究和分子診斷的重大意義也在於指導靜脈血栓患者個體化治療，為先證者家族成員提供早期診斷和臨床前預防依據。例如，血栓性疾病患者若診斷為遺傳性AT缺乏症（SERPINC1基因突變），選用肝素治療效果往往不佳，這是因為肝素是AT的輔因子，最終還是需要通過AT發揮抗凝作用。這種情況下，使用華法林或者凝血因子X抑制劑抗凝治療效果較好，如選用肝素，初始負荷劑量要相應增加。如果分子診斷證實存在單一或者複合遺傳缺陷，同時血栓形成反覆發生者，原則上需要長期抗凝治療；存在遺傳缺陷的初發血栓形成者，以及尚未發現遺傳缺陷的復發性靜脈血栓形成者，需治療後密切隨訪觀察；不存在遺傳缺陷的初發血栓形成者，原則上無需長期抗凝治療。
同時，研究發現的THBD c. —151G>T是中國人群靜脈血栓形成密切相關的遺傳危險因素。這對未來的血栓遺傳學研究有重要的提示，即在各個國家、民族、人群中，開展大規模的止血相關基因重測序研究，才能有助於發現真正的與本研究人群血栓形成有關的遺傳易感因素。這一點對非洲人群更為有用，因為研究表明非洲國家的靜脈血栓形成發病率是各民族中最高的，然而至今尚未發現與非洲人群靜脈血栓相關的常見遺傳危險因素。
4、展望
靜脈血栓形成在全世界範圍內有較高的危害，其中遺傳性因素在靜脈血栓的發病中起到決定性作用。本研究選擇TM的編碼基因THBD作為目標基因，取得了突出的研究成果。自上世紀60年代起，世界範圍內陸續報導了數十個能增加靜脈血栓風險的基因，主要易栓基因的發現時間和相對風險如圖1所示[框內為得益於全基因組關聯研究（GWAS）技術而發現的易栓基因。近年來，由於GWAS和外顯子組研究技術迅速發展，發現了數百種與多基因疾病相關的高頻率危險等位基因以及一些與疾病相關的新的候選基因，為疾病發生的生物學過程指出了一些新的機制。然而對大部分GWAS來說，始終不能準確定位有害基因變異的位置，也不能在生物學上解釋相關多態性的功能影響。並且通過GWAS技術發現的多數易栓基因相對危險度較低，多數在1.2以內。
家系分析在發現高相對危險度的易栓基因中仍然發揮重要作用。近年的報導發現，未攜帶目標易栓基因的家系成員，發生靜脈血栓的風險同樣有一定程度的提高，提示還可能存在已知易栓基因之外的遺傳性致病因素。
此外，攜帶多種易栓基因的人群靜脈血栓發病率明顯增加，提示靜脈血栓的危害評估可能會形成多種基因突變累加的積分形式暡暢。有研究表明，深靜脈血栓和肺栓塞作為靜脈血栓的主要成員，兩者的遺傳性致病因素也存在較大差異，必要時可將兩者作為獨立的病種進行研究。
總之，隨著對靜脈血栓遺傳危險因素的深入研究，發現了越來越多的靜脈血栓致病基因，本文的技術路線可作為靜脈血栓遺傳危險因素研究的參考。隨著基因診斷越來越多的應用於臨床，期待通過研發新的靶向性治療藥物以及新興基因修復技術來更加有效的治療靜脈血栓。
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