一、原理
500ml水樣用 C18 固相提取小柱提取，用甲醇洗脫，最後提取液濃縮至 1ml。樣品用 C18 色譜柱在配有紫外檢測器的高效液相色譜儀系統上進行分離檢測。
二、試劑和材料
2.1 試劑水，純水，其中不含任何超過檢出限的目標待測物，或超過檢出限之三分之一的幹擾物質。
2.2 乙腈，HPLC 級。
2.3 甲醇，HPLC 級。
2.4 丙酮，HPLC 級。
2.5 25mM 磷酸緩衝液，用於高效液相色譜儀流動相。取 0.5M 磷酸鉀儲備液(3.5.1)和 0.5M 磷酸儲備液(3.5.2)各100ml，與試劑水稀釋至 4L。溶液 pH 應該約為 2.4。該值應該用 pH 計測量。用 0.45m 尼龍膜過濾備用。
2.5.1 磷酸鉀儲備液(0.5 M) ，稱取 68 g KH 2 PO 4 ，用 1L 試劑水溶解。
2.5.2 磷酸儲備液(0.5M) ，取 34.0 ml 磷酸( 85%, HPLC 級)，用試劑水稀釋至 1L。
2.6 樣品保護試劑，硫酸銅，CuSO4·5H 2 O，分析純，用於殺菌劑，防止微生物將被測物降解。
2.7 標準樣品溶液
2.7.1 待測物儲備標準溶液，除了賽苯隆和除蟲脲外，其它化合物用甲醇溶解。賽苯隆和除蟲脲在甲醇中溶解度有限，用丙酮溶解。只要進樣體積如方法指定儘可能小，丙酮就不幹擾分析。儲備液在-10°C 以下可儲存 6 個月。
2.7.1.1 準確稱取 25-35mg（精確到 0.1mg）可在甲醇中溶解的待測化合物，放入 5ml 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度。
2.7.1.2 賽苯隆和除蟲脲應該溶於丙酮中。準確稱取純物質（精確到 0.1mg）10-12mg，置於 10ml 容量瓶中。塞苯隆難以溶解，但 10mg 純物質應該溶於 10ml 丙酮中。超聲可有助於溶解。
2.7.2 分析用標準樣品（濃度, 200g/ml 和 10g/ml），由儲備標準溶液稀釋而來。先用適量甲醇將儲備標準溶液稀釋至 200g/ml 溶液。如需 10g/ml 濃度的標準溶液，可用 200g/ml 的標準溶液進行進一步的稀釋而得。上述標準溶液可以用於校正標樣，並可以在-10°C 下穩定存放三個月。
2.8 固相提取用材料
2.8.1 固相提取小柱，6ml 裝有 500mg（40m 直徑）矽膠基質 C18 填料的小柱。
2.8.2 真空提取裝置，帶流速/真空控制功能。使用導入針或閥避免交叉汙染。
2.8.3 離心管，15ml，或其它適於容納小柱提取洗脫液的容器。
2.8.4 提取液濃縮系統 1，可以使 15ml 試管在 40°C 水浴下加熱，並同時用氮氣吹掃到一定體積。
三、儀器
3.1 高效液相色譜儀，配紫外檢測器或光電二極體陣列檢測器。
3.2 首選色譜柱，4.6×150 mm，3.5m dp C18 色譜柱。
3.3 確認色譜柱，4.6×150mm，5m 氰基柱，必須與首選色譜柱具有不同的選擇性，具有不同的洗脫次序。
四、分析步驟
4.1 固相提取步驟
4.1.1 小柱活化
小柱一旦被活化，則需在上樣完成前一直保持浸潤狀態，不能幹涸。否則降低回收率。用 5ml 甲醇浸潤小柱填料約 30 秒（暫時停止真空），使之活化。期間不能讓甲醇液面低於填料上部。用甲醇活化後，用兩份 5ml 試劑水平衡小柱。小心控制真空使填料保持浸潤狀態。在上樣之前，在小柱上再加入約 5ml 試劑水。
4.1.2 上樣
打開真空，以 20ml/min（minus9-10i，Hg）的流速讓樣品溶液通過小柱。注意：在所有樣品通過小柱前，小柱不能幹涸。樣品全部通過小柱後，抽真空（minus10-15，Hg）約 15 分鐘，放掉真空。
4.1.3 小柱洗脫
在小柱中加入 3ml 甲醇，使小柱讓甲醇充分浸潤。放掉真空，允許小柱填料讓甲醇浸潤 30 秒。打開真空，以低真空度（minus2-4，Hg）將樣品用甲醇從小柱中洗脫出來，洗脫溶液應成滴流出至收集管。用 2ml 甲醇再重複上述操作。第三次用 1ml 甲醇洗脫。
4.1.4 洗脫液濃縮
用 40°C 以上的水浴在氮氣流的吹掃下，將洗脫液濃縮至 0.5ml。轉移至 1ml 容量瓶。用少量甲醇洗滌收集管。
4.2 高效液相色譜儀分析
4.2.1 首選分析柱：C18, 4.6×150 mm，3.5 m C18 色譜柱。
條件：溶劑 A：25 mM 磷酸緩衝液；溶劑 B：乙腈。梯度變化（見下表）：
檢測波長：245 nm。下次進樣前平衡 15 分鐘。
4.2.2 確認色譜柱： 4.6 × 150 mm，5 m 氰基固定相色譜柱。
條件：溶劑 A： 25 mM 磷酸緩衝液；溶劑 B：乙腈。梯度變化(見下表)：
平衡時間：15 分鐘。檢測波長：240 nm。
圖 1: C18 色譜柱：分離結果
圖２: 確認柱-氰基柱：分離結果