CRISPR-Cas9技術及其在腫瘤研究中的應用

CRISPR的前世今生

1987年，日本科學家在研究大腸桿菌的時候發現其基因組上存在一些看起來「奇怪」的重複結構：有一段29鹼基的序列反覆出現了5次，且兩兩之間被32個鹼基形成的序列隔開了！但這個發現在當時並沒有引起科學界的很大關注，畢竟在自然界的生物體內，各種奇奇怪怪的發現實在太多。然後僅僅幾年後，1993年西班牙科學家弗朗西斯科莫西卡在另外一種細菌——地中海噬鹽菌中又一次發現了這種奇特的重複序列，這引起了莫西卡的興趣，於是莫西卡在其他細菌中繼續尋找，到2000年，莫西卡竟然在超過20種不同微生物體內發現這種重複DNA結構，從此這種重複序列就有了其學術大名：成簇的規律間隔的短回文重複序列（Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。

對於任何有機生命體來說，保存、複製和傳遞遺傳物質都是一件非常精細、困難也很佔用資源的事情，因此在這麼多不同的物種中都保留了這麼一長串的CRISPR序列，必定有其重要的用處。隨後，科學家通過對比多種細菌的幾千段CRIPSR序列後發現，在CRIPSR序列中存在許多片段與病毒的基因組序列高度一致，雖然不是完整的病毒基因組序列，但這些序列被夾在一段細菌精心設計的重複序列中，進一步的研究證實，這些與病毒基因組高度一致的序列來自於「噬菌體」——一類可以感染和侵襲細菌的病毒，這不禁讓人聯想到細菌會不會是靠對CRISPR序列的「記憶」來發揮其對噬菌體的免疫。2007年，一群在杜邦公司旗下的丹尼斯克食品配料公司工作的科學家在嗜熱鏈球菌中證明了CRISPR序列對於細菌免疫系統的功能，自此，CRISPR技術才開始走進科學家的視野。

2013年，Jennifer Doudna、哈佛大學醫學院的George Church和麻省理工大學博德研究所的張鋒分別帶領3個研究團隊相繼證明了CRISPR序列與Cas9蛋白結合可以在人類細胞中高效地定位、剪切和修改基因組。2014年，美國專利與商標局將CRISPR-Cas9技術相關的第一個專利授予給張鋒所在的博德研究所，並將張鋒作為專利的第一發明人，這也開啟了張鋒和Jennifer Doudna漫長的專利之爭。2019年，張鋒團隊在Nature communications發表論文，稱開發了第三種基因編輯工具CRISPR-Cas12b，並能在哺乳動物和人體中進行有效的基因編輯，同年8月，瑞士蘇黎世聯邦理工學院（ETH）的研究團隊實現了同時對細胞內25個基因靶點進行編輯，為CRISPR-Cas技術帶來了革命性突破。

認識CRISPR-Cas9

基因編輯技術是對細胞中的DNA序列進行精準操作從而改變細胞命運和生物體特徵的技術，該技術為提高人類對於遺傳學的理解以及遺傳疾病的治療提供了重要的工具。CRISPR/Cas9系統主要由Cas9蛋白和單鏈嚮導RNA（sgRNA）所組成，其中Cas9蛋白起切割DNA雙鏈的作用，sgRNA起嚮導的作用，在sgRNA的嚮導下通過鹼基互補配對原則Cas9蛋白可對不同的靶部位進行切割，實現DNA的雙鏈斷裂（如下圖）。CRISPR-Cas9是繼鋅指核酸內切酶（ZFN）和類轉錄激活因子效應核酸酶（TALEN）之後出現的第3代基因編輯技術，與ZFNs和TALENs的Fok I酶只有在二聚化才具有切割活性不同的是，Cas9在sgRNA的引導下以單體蛋白的形式就可發揮功能，從而避免了複雜的蛋白設計或組裝的需要。CRISPR-Cas9的編輯效率和精確性相比於ZFN和TALEN有了顯著提高，其應用領域也開始從遺傳性疾病擴展到更多複雜的疾病，目前，CRISPR-Cas9技術已經被用於操縱培養細胞和原代細胞、編輯動物和植物的基因組，極大地加快了基礎研究的步伐。

CRISPR系統要實現sgRNA和Cas9蛋白的遞送，通常可從DNA水平、RNA水平和蛋白水平進行遞送，即遞送含編碼Cas9蛋白和sgRNA的質粒、遞送sgRNA和編碼Csa9蛋白的mRNA，直接遞送sgRNA和Cas9蛋白。其中從DNA水平遞送編碼Cas9蛋白和sgRNA質粒的方式有病毒法、電轉法和脂質體法，其中病毒法具有操作簡單、成本低和穩定性高的特點，是目前較為常用的一種方式，但也存在脫靶率較高和基因整合的風險。而從RNA水平的遞送則是將編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA遞送到細胞質，在核糖體的作用下翻譯成蛋白質，由於mRNA在體內或體外均容易降解，此方式需要採用合適的方法保護mRNA不受降解。而遞送Cas9蛋白和sgRNA則最為直接簡便，由於不用經歷轉錄和翻譯過程，使得編輯過程更加快速高效，且脫靶率更低，但此方法的難點在於遞送載體的選擇和構建，開發新型載體如脂質體、金納米顆粒、陽離子聚合物等對於此方法的廣泛應用十分重要。

病毒載體和蛋白-RNA複合物電穿孔是目前CRISPR常見的兩種遞送方式，其中體外研究較受歡迎的運輸方式是將Cas9組裝進蛋白-RNA（核糖蛋白複合物，RNP）複合物然後使用電穿孔進行運輸，而體內運輸釋放過程具有更大的挑戰性，一般會採用病毒載體進行運輸。病毒載體包括慢病毒（LV）、腺病毒（AdV）以及腺相關病毒（AAV），相比於其他載體，病毒載體在運輸效率以及組織特異性方面具有很大優勢。近幾年，由於AAV載體特有的優勢，如具有組織特異性以及較低的免疫原性，使其在應用於基因治療產品開發上表現出了極大的潛力。電穿孔法則是體外細胞基因編輯元件運輸的主要方式，通過高壓電流脈衝細胞，在細胞膜上產生瞬間的納米級孔隙，從而允許RNP進入細胞，幾乎所有類型的細胞，一旦確定了電穿孔條件，都可以實現較高效率的瞬時和穩定轉染，但高壓脈衝引起大量細胞死亡和僅部分成功的膜修復，與化學轉染方法相比需要使用更大量的細胞。

CRISPR-Cas9在腫瘤研究中的應用

目前CRISPR-Cas9技術主要用於細胞和動物水平的模型建立，而在腫瘤研究領域，已有多種基於CRISPR-Cas9系統的腫瘤細胞和動物模型被成功建立，並用於腫瘤基因、藥物靶點和耐藥性等方面的臨床前驗證。

1. 在體內動物模型的應用

癌症動物模型的建立是研究癌症相關基因功能的一個重要手段，CRISPR/Cas9技術極大地簡化了癌症動物模型的建立，降低了成本又加快了建模周期。目前，採用CRISPR/Cas9建立的腫瘤動物模型最常用的為小鼠，其次為大鼠、豬等。例如張峰團隊通過CRISPR/Cas9技術成功地構建了小鼠肝癌和肺癌模型，他們首先利用Cre-loxP系統將Cas9基因敲入小鼠體內，構建Cas9小鼠模型後，將篩選出來的3個基因：KRAS、p53和LKB1基因的sgRNA分別轉導入小鼠體內，模型鼠發展出了肉眼可見的肺腺癌病理表徵，從而證明了KRAS、p53和LKB1基因在肺腺癌發生發展過程中的作用[1]。賽業生物採用基於傳統CRISPR/Cas9升級而成的CRISPR-Pro技術已經為數千位科研人員成功構建了腫瘤研究相關的基因編輯小鼠和大鼠模型，且研究成果在Nature Communication、Leukemia等頂尖期刊發表。

2. 在體外細胞模型的應用

對於發病機制並不明確的癌症，通過CRISPR/Cas9技術可研究特定基因在腫瘤發生和進展過程中的作用。目前採用CRISP/Cas9技術建立的腫瘤模型有肺癌、乳腺癌和急性髓細胞白血病細胞系等，例如有研究者採用CRISPR/Cas9技術實現沉默骨肉瘤細胞系KHOS和U-2OS中CDK11基因表達，發現CDK11基因沉默後骨肉瘤增殖和侵襲能力顯著減弱[2]。慢性髓系白血病的發生常與體內抑癌基因ASXL1的突變有關，並且影響患者的預後。另外有研究者利用CRISPR/Cas9技術靶向修復了KBM5細胞中ASXL1的無效突變，顯著降低了KBM5細胞的增殖速率，增強了細胞的分化，並且經過ASXL1基因修復的荷瘤小鼠的生存時間較未經ASXL1修復的荷瘤小鼠生存時間長。另外，劍橋大學等多個研究機構的科研人員對來自30種不同惡性腫瘤的324種腫瘤細胞系進行了基因組規模的CRISPR/Cas9篩選，發開了名為Project Score的資料庫，從而為尋找腫瘤的作用靶點提供幫助。賽業生物提供的細胞基因編輯服務已經在198種腫瘤細胞上成功構建了基因敲除、基因敲入的細胞模型，例如採用CRISPR-Pro技術進行細胞基因敲除可實現大片段的基因敲除，相比於常規的移碼突變敲除得更加徹底。

CRISPR/Cas9技術在未來腫瘤研究及治療方面的發展潛力是無限的，但是我們必須清醒地認識到，這項技術還存在很多尚未解決的問題，比如脫靶效應，應用於人體時的倫理問題、安全性問題等。但可以預見的是，隨著CRISPR/Cas9技術的不斷創新最終會解決上述難題，為腫瘤的治療研究提供新的思路和方向，為腫瘤患者帶去新希望。