Environmental Microbiology：趨磁細菌生物與礦物多樣性鑑定及其相關性研究

劉沛餘等-EM：趨磁細菌生物與礦物多樣性鑑定及其相關性研究

摘要：微生物是地球上出現最早、種類和數目最多、功能最全的一種生命形式。通過礦化作用，微生物直接參與地球上至少六十餘種礦物的形成和轉化。研究自然界中能夠礦化的微生物及微生物形成的礦物對認識現今和地質歷史時期的微生物參與及微化石記錄的地球與生命演化過程具有重要指示意義。然而，自然環境中的微生物一般多雜居混生，且超過99.99%的微生物還不能在實驗室實現純培養。如何開展環境中未培養微生物的種類鑑定和深入研究，是當前地質微生物學領域研究的熱點和難點。近日，中國科學院地質與地球物理研究所地磁場與生物圈演化學科組研究團隊聯合國內外多個單位科研人員，利用「螢光-電子顯微鏡聯用」新技術（FISH-SEM和FISH-TEM），對自然環境中一類「既能利用地磁場定向遊泳，又能在細胞內礦化合成納米級磁鐵礦（Fe₃O₄）磁小體」的原核微生物——趨磁細菌，進行了迄今為止最大規模的生物和礦物多樣性鑑定，從單細胞水平上鑑定了20種新型的趨磁球菌。系統發育分析表明，這些趨磁球菌屬於變形菌門（Proteobacteria）一個新的綱—η-變形菌綱；透射電鏡分析表明，這些趨磁球菌合成的磁小體形貌和結構多樣，但具有菌種或菌株特異性。研究表明，磁小體的生物礦化過程受到趨磁細菌基因水平上的嚴格調控，磁小體的形貌和結構特徵與趨磁細菌的種類存在一定程度的對應關係，因此沉積物或巖石中磁小體有望成為古趨磁細菌研究的化石材料。

1974-1975年，美國微生物學者理察·布萊克莫(Richard P. Blakemore)在研究海洋淤泥中螺旋菌時，意外發現一類球形細菌，能識別地磁場或外加磁場，順著磁力線方向遊泳而聚集在水滴邊緣，這些球菌還能在細胞內合成鏈狀排列的納米四氧化鐵（Fe₃O₄）顆粒。在隨後發表的Science文章中，他將這類細菌命名為趨磁細菌（magnetotactic bacteria），將這些細胞內納米磁性顆粒命名為磁小體（magnetosome），將趨磁細菌這種沿磁力線遊泳行為稱為趨磁性（magnetotaxis）。布萊克莫的這一發現，重新喚起了人們對義大利學者Bellini在1950-1960年代從淡水環境發現的一類磁敏感細菌的重視，同時也迅速吸引了微生物學、物理學和地球科學等多領域科學家極大的興趣，從此拉開了趨磁細菌研究的序幕。

40多年來，來自英、德、日、巴西和中國等來自生命、地球、海洋、物理和材料科學等不同領域的科學家陸續加入到趨磁細菌的研究行列，重點在趨磁細菌的生態分布和種類多樣性、磁小體生物礦化過程及其分子機制、磁小體化石識別及古地磁學應用、以及磁小體生物仿生和納米醫學應用等方面開展了大量研究。這些研究表明，磁細菌具有全球分布，其細胞種類（系統發育）和磁小體晶型均具有豐富的多樣性，表明其生物礦化機制也可能多樣。針對未培養趨磁細菌，前人多採用不依賴純培養的分子生態學（16S rDNA序列測定）研究其系統發育，採用透射電鏡技術研究磁小體的形貌、尺寸、結構、成分和細胞內的組裝結構等性質，從而認識趨磁細菌的生物礦化過程和機理。然而，磁小體晶形觀測難以與系統發育直接建立聯繫，除了少數幾種趨磁細菌外，大量的未培養趨磁細菌的種類與磁小體晶型在細胞水平上的一一對應關係並未建立，制約了全面認識趨磁細菌的生物礦化機制。

特別指出的是，儘管趨磁球菌是最早被發現的趨磁細菌，也是自然環境中分布範圍最廣、數目最多的趨磁細菌，但對這類細菌的認識相對是最不清楚的。主要表現在：（1）由於其培養條件十分苛刻，目前純培養的趨磁球菌只有三株，分別是Magnetococcus marinus strain MC-1, strain MO-1和 Magnetofaba australis strain IT-1，均為海洋單鏈趨磁球菌。（2）儘管前人的研究中獲得了大量的趨磁球菌16S rDNA序列，但是由於不同種類的趨磁球菌形貌極其相似，用傳統的螢光原位雜交技術難以將它們的系統發育信息和細胞、磁小體形貌結構等特徵對應起來，從而限制了對這類細菌生物礦化機制的深入認識。（3）由於純培養和成功鑑定的趨磁球菌種類相對較少，對這類細菌的系統發育分類存在爭議。

自2015年起，中科院地質地球物理所李金華研究員與潘永信院士團隊，聯合中科院物理所、山東大學、法國巴黎第六大學、澳大利亞國立大學等國內外多個單位的科研人員針對環境中未培養的趨磁細菌，開展生物地磁學和地球生物學多學科交叉研究。他們首先建立了一種「螢光-電子顯微鏡聯用」新技術（FISH-SEM和FISH-TEM），將趨磁細菌種類鑑定的螢光顯微鏡觀測信號與磁小體結構觀測的電子顯微鏡觀測信號結合起來，首次在單細胞水平實現了未培養趨磁細菌的種類鑑定和生物礦化研究（圖1）。在此基礎上，該研究團隊對來自北京密雲水庫、西安未央湖、天津於橋水庫、秦皇島石河入海口以及大連夏家河等淡水、海水以及半鹹水環境的沉積物中的趨磁球菌進行首次大規模的生物和礦物多樣性鑑定，在單細胞水平上鑑定了20種新型的趨磁球菌（圖2）。其中，有12株是前人從未報導過的新序列（16S rDNA與所有前人報導過的序列相似度均低於97%），另外8株與前人報導過的序列有較高（≥97%）相似度，但磁小體的形貌和結構未被鑑定（Zhang et al., 2017；Liu et al., 2020）。

圖1 螢光-電子顯微聯用技術鑑定環境樣品中未培養趨磁球菌。（A-D）BHC-1（來自北京北海）。（E-H）LLTC-1（來自秦皇島老龍頭海域）。（I-L）DMHC-2（來自山東濟南大明湖）。（M-P）MYC-3（來自北京密雲水庫）。該技術基於趨磁細菌的16S rRNA基因序列，設計特異性的寡核甘酸探針，通過改進傳統的螢光原位雜交（FISH）技術的制樣和觀察環節，實現了螢光顯微鏡下對經寡核苷酸探針特異性雜交的趨磁細菌進行單細胞水平的觀察和識別，然後通過掃描電鏡和透射電鏡對同一微區或同一個細胞進行納米尺度的形貌和結構分析，從而實現對同一個趨磁細菌細胞在單細胞水平上的種類鑑定（系統發育）和在納米尺度上的生物礦化研究（細胞和礦物形貌結構等）（Li et al., 2017）

圖2 20種趨磁球菌的生物（系統發育）和磁小體形貌多樣性。（A）基於16S rDNA序列的趨磁球菌系統發育進化樹。（B-U）20株趨磁球菌的透射電子顯微鏡照片。圖A每個細菌後的編號與透射電鏡中顯示的細菌是一一對應的

在成功鑑定了這20株未培養趨磁細球菌的基礎上，該研究團隊綜合微生物分子生態學和透射電子顯微學，對這些趨磁細菌進行了深入研究。系統發育分析結果顯示，所有的趨磁球菌的16S rDNA序列都聚類在變形菌門一個獨立的分支上。這支持了前人認為趨磁球菌應獨立為變形菌門當中一個新的綱——η-變形菌綱的觀點（圖3）。

圖3 趨磁球菌屬於變形菌門的一個新綱——η-變形菌綱。本圖共總結了29種趨磁球菌，其中前人共鑑定了了9種，其餘20種為本研究團隊所鑑定

電子顯微學分析結果表明，趨磁球菌均為直徑在~1.0微米到~2.5微米之間的球型或卵球型細胞。此外，趨磁球菌的磁小體鏈結構分為四類，分別為單鏈、雙鏈、四鏈和非直鏈排列。磁小體的形貌有八面體、立方八面體和拉長的稜柱形。大多數趨磁球菌能合成10個左右的磁小體，但部分菌株，如DMHC-6和WYHC-2，幾十個到上百個左右的磁小體。磁小體的平均長度在60 nm到114 nm之間，平均寬度在36 nm到86 nm之間（圖4-圖7）。

圖4 6種趨磁細菌合成單鏈磁小體。（A-F）磁小體鏈的透射電鏡照片。（G-I）磁小體長、寬和寬/長比的平均值

圖5 5種趨磁球菌合成雙鏈磁小體。（A-E）磁小體鏈的透射電鏡照片。（F-H）磁小體長、寬和寬/長比的平均值

圖6 三種趨磁球菌合成兩條雙鏈磁小體。（A-C）磁小體鏈的透射電鏡照片。（D-F）磁小體長、寬和寬/長比的平均值

圖7 6種趨磁球菌不合成直鏈排列的磁小體。（A-F）磁小體鏈的透射電鏡照片。（G-I）磁小體長、寬和寬/長比的平均值

為了進一步研究趨磁球菌種類和磁小體形貌之間的關係，該研究團隊基於磁小體鏈結構、數目、寬度和寬長比數據，進行了非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling, nMDS)。結果顯示，代表同種趨磁球菌的磁小體形態學數據的點聚在一起，代表不同種趨磁細菌磁小體數據的點彼此遠離。這說明趨磁球菌的生物學種類和磁小體形貌結構特徵是一一對應的，即礦化產生的磁小體具有一定程度的菌種或菌株特異性（圖8）。

圖8 趨磁球菌種類與磁小體形貌結構之間相關性的nMDS分析結果。趨磁球菌可以按照磁小體鏈結構聚類並分開，且每種趨磁球菌也可聚類並相互之間分開

本研究完善並發展了研究團隊前期建立的「螢光-電子顯微鏡聯用」新技術，並將該方法應用到「自然界分布最廣、數量最多，但相對最難識別、認識程度最低」的一類趨磁球菌的種類鑑定和生物礦化研究中，首次在單細胞水平上大規模鑑定了20種新型趨磁球菌。結合前人總共鑑定的9種趨磁球菌數據，系統發育分析證實趨磁球菌應該從α-變形菌綱中剝離出來，成為一個新綱——η-變形菌綱。透射電鏡分析表明，趨磁球菌磁小體具有豐富的鏈組裝模式、形貌和結構多樣性，尤其是6種非直鏈磁小體結構的趨磁球菌的鑑定和發現，表明磁小體的直鏈排列並不是趨磁細菌組裝磁小體的必要模式，因此這類非直鏈組裝磁小體的生物礦化和磁學性質值得進一步深入研究。趨磁細菌生物種類與其磁小體形貌結構特徵的綜合分析表明，磁小體生物礦化過程和機制在一定程度上具有菌種或菌株特異性，這為未來通過沉積物或巖石中磁小體來追溯古趨磁細菌的生物學信息提供了理論依據。

研究成果發表於Environmental Microbiology。（Liu P, Liu Y, Zhao X, et al. Diverse phylogenyand morphology of magnetite biomineralized by magnetotactic cocci[J].Environmental Microbiology, 2020.DOI：10.1111/1462-2920.15254.）本研究受中國國家自然科學基金重點國際（地區）合作研究項(41920104009)、國家自然科學基金重大項目課題（41890843）和國家自然科學基金創新研究群體項目（41621004）資助。

校對：張崧