Nature子刊:AAV介導的體細胞基因編輯,改善杜氏肌營養不良症

杜氏肌營養不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是X染色體隱性遺傳疾病，常見於男孩，會引發兒童的肌肉退化並由於呼吸和心臟衰竭而引發早亡。大多數的病人帶有DMD基因編碼的肌營養不良蛋白（Dystrophin）的移碼突變，該移碼突變會造成外顯子刪除進而造成該蛋白表達缺失。由於DMD在X染色體上的定位使得每3500-5000個新生男孩中就有一例杜氏肌營養不良患者。目前反義寡核苷酸介導的外顯子跳躍式重組DMD轉錄已被轉化為臨床試驗，但由於反義寡核苷酸的對於DMD表達僅具有暫時的、有限的作用，在臨床方面應對杜氏肌營養不良還沒有更加行之有效的手段。

為了找到杜氏肌營養不良的治療方案，2020年1月27日，慕尼黑工業大學和德國心血管研究中心C. Kupatt研究組在Nature Medicine題為：Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy的論文，使用腺相關病毒（AAV）的靜脈注射方式在體內利用基因編輯技術恢復的病人體內肌營養不良蛋白的表達，為杜氏肌營養不良的患者提供了可能的治療手段。

在小鼠模型中，基於內切酶的基因編輯策略提供了更有效和更持久的基因組校正。最近，在犬類模型中使用基於腺相關病毒AAV9靜脈注射的技術將CRISPR-Cas9組分的送入體內能夠恢復包括心肌在內的肌肉中肌營養不良蛋白的表達。

但是到目前為止，該技術在體內的功能性方面的實驗數據還未見報導。作者們在之前的工作中建立了一個DMD基因 exon52缺失的豬模型，該外顯子的缺失會造成肌營養不良蛋白表達的完全缺失。作者們在此豬模型中注射CRISPR-Cas9靶向exon51的gRNAs組分，在豬模型體內恢復了一個短截但表達穩定版本的肌營養不良蛋白ΔE51-52(圖1)。

圖1 在豬模型中進行的DMD基因編輯恢復短截版肌營養不良蛋白的表達

通過質譜分析後，作者們發現此種短截版本的肌營養不良蛋白的產生一定程度上糾正了DMD移碼突變引發的蛋白質調控異常。在DMDΔ52模型中，由於缺少肌營養不良蛋白會造成肌營養不良蛋白相關糖蛋白複合體(Dystrophin-associated glycoprotein complex, DGC)表達的缺失。而在對豬模型進行腺病毒處理之後，作者們發現DGC的表達被恢復。DMDΔ52模型顯示，在雄性後代出生後61.6%一周內死亡，全部雄性幼體無一存活超過105天。而在基因編輯處理之後，存活天數最大達到136天。為了進一步確認基因編輯之後對於杜氏肌營養不良的功能方面的作用，作者們檢測了對於DMD心臟整體功能和心律失常等病理性特徵的影響。在對DMDΔ52豬模型施用了基因編輯的腺病毒靜脈注射之後，通過去除外顯子51改善了該疾病模型中固有的心律失常的病理性特徵。

進一步地，作者們希望在人類細胞中進行相應的檢測。作者們從病人體內產生了一個帶有DMD exon52刪除(hDMDΔ52)的誘導多能幹細胞株系，會引起外顯子53提前終止。hDMDΔ52細胞表達的骨骼肌基因水平顯著降低，並且無法生成多核且自發收縮的肌管。而在同樣進行基因編輯處理切除外顯子51重新表達短截版本的肌營養不良蛋白後，誘導多能幹細胞產生的心肌細胞的心律失常等缺陷被修復了。

圖2 人體誘導多能幹細胞hDMDΔ52進行基因編輯後恢復肌管細胞的產生

總的來說，作者們的工作在大動物疾病模型中使用體細胞基因組編輯的方式能夠改善杜氏肌營養不良疾病引發的肌肉無力、心肌疾病和過早死亡，從體內和體外均證明了該基因編輯恢復了DMD閱讀框。

基因編輯後形成短截版本的肌營養不良蛋白也足以恢復肌肉的功能和移動性從而阻止惡性心律失常來延長杜氏肌營養不良DMDΔ52豬模型的壽命。在臨床方面，腺相關病毒基因編輯技術在杜氏肌營養不良患者身上的應用仍待進一步地證明。

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本文來源：BioArt

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