按：這項研究可以用9個字來總結「試一下，猜一下，投一下」，整個工作完完全全不是計劃出來的，體現了科學的奧妙和不可預測性。「試一下」：我們的原初目的是在肺結核分枝桿菌蛋白質晶片進行第二信使c-di-GMP效應蛋白的全局性發現。因為當時該晶片還沒有出來，所以就先拿現成的大腸桿菌蛋白質晶片練手，結果就意外的發現了CobB。「猜一下」：在對第二信使c-di-GMP如何影響CobB的活性進行了較為精細的研究後，基於對蛋白質乙醯化和CobB的了解，我們猜測CobB是否有可能反過來影響c-di-GMP的胞內水平，結果發現很有意思，猜對了。「投一下」：其實是投了好多下，整個投稿的過程，感覺就是在帶學生坐過山車，起起落落，好在最後一段算還比較平穩。開始一項工作很容易，但把持住正確的方向，高質量地完成卻常常並非易事。完成一項在科學上有那麼一點價值的工作，在大方向不錯的前提下，首要條件是有能幹、主動積極、執行力強且有較強心理承受能力的學生。另一個重要條件是有一幫隨時能提供實質性幫助的朋友和合作者，「獨木不成林，一人不為眾」，做人RP很重要，做科研亦如此。
2019年8月17日，上海交通大學系統生物醫學研究院陶生策課題組在The EMBO Journal雜誌發表了研究成果Interplay between the bacterial protein deacetylase CobB and the second messenger c-di-GMP，該文章首次揭示了細菌去乙醯化酶CobB和第二信使分子c-di-GMP在體內的相互調控關係。
解析小分子與蛋白相互作用在生物學研究中有重要的意義，我們實驗室基於蛋白質晶片平臺，在小分子藥物作用靶標（Zhang et at., PNAS, 2015）和第二信使c-di-GMP效應蛋白（Zhang et al., Sci Rep.2017）前期進行了一些探索。本研究在這些前期研究的基礎上的一個嘗試，我們利用大腸桿菌蛋白質組晶片（4016種蛋白質），全局性地尋找第二信使c-di-GMP在大腸桿菌中的效應蛋白。利用生物素標記的c-di-GMP與晶片反應，我們找到8個與c-di-GMP相互作用的蛋白質，其中一個是蛋白質去乙醯化酶CobB。進一步的體內實驗表明，在大腸桿菌中c-di-GMP通過結合抑制CobB的去乙醯化酶活性進而調控CobB-Acs（乙醯輔酶A合成酶）-CoA途徑中乙醯輔酶A的最終合成。緊接著，通過SILAC實驗發現c-di-GMP能夠全局性地抑制CobB在大腸桿菌體內的活性。
另一方面，本研究還發現大腸桿菌c-di-GMP合成酶DgcZ在體內能夠被乙醯化，且DgcZ K4位點的乙醯化可以被CobB去除進而提高DgcZ活性，並最終調控c-di-GMP水平。在分子機制方面，我們發現DgcZ K4乙醯化導致其多聚和沉澱，而CobB的去乙醯化能夠提高DgcZ的穩定性。
總之，本研究揭示了細菌去乙醯化酶CobB和第二信使c-di-GMP是相互調節的，在體內形成了一個負反饋調節通路，為c-di-GMP研究提供了全新的效應蛋白，也為CobB在體內的調控因子提供新的證據。
背後的故事：
我們實驗室一直以來更大的關注點是結核分枝桿菌的基礎研究，所以想利用結核分枝桿菌蛋白質晶片來尋找c-di-GMP在結核分枝桿菌內的新的效應蛋白，在這之前就安排張海南師姐用大腸桿菌蛋白質晶片做了預實驗來確定方案是否可行。在大腸桿菌晶片上，我們驚喜的發現c-di-GMP能夠與8個蛋白相互作用，且其中有我們感興趣的蛋白質去乙醯化酶CobB。當時我是剛加入Tao lab一年，做的是蛋白質晶片資料庫的項目，陶老師便建議我去驗證一下c-di-GMP對CobB酶活的影響（當時並沒有抱太大的期望，而且當時我還是新手，陶老師可能想的是讓我練練手）。幸運的是，通過體外酶活實驗，我們證實了c-di-GMP確實能夠抑制CobB的去乙醯化酶活性。基於此，我們就想解析CobB與c-di-GMP的結合位點，首先想到的是將兩者共結晶，所以我們找到了清華大學的李海濤老師進行合作，但是因為CobB的N端精氨酸含量高，我們始終沒有辦法得到很好的共結晶結果。在一次偶然的實驗中，李老師課題組發現，對CobB的N端進行截斷後，能夠使得CobB蛋白變得穩定，但同時也使得c-di-GMP無法結合到CobB，所以這提示我們c-di-GMP是結合在CobB的N 端。基於這個線索，我們對CobB N端的37個胺基酸進行了點突變，找到了3個（R8, R17, E21）關鍵的c-di-GMP結合位點。
在完成了c-di-GMP對CobB活性影響的研究之後，我們就把這個工作做了整理並準備投稿，但在一次討論中，陶老師提到CobB作為去乙醯化酶，擁有很廣泛的底物，那麼CobB是否有可能反過來影響c-di-GMP的合成？為了驗證這一想法，我們選取了大約12個與c-di-GMP合成和降解相關的蛋白，進行乙醯化和去乙醯化的驗證。在這個實驗中，我們發現DgcZ（大腸桿菌中活性最高的c-di-GMP合成酶之一）在體內可被乙醯化，而且能夠在體外被CobB去乙醯化。通過體內和體外的酶活實驗表明CobB的確能夠調控c-di-GMP的合成。
在完成CobB對c-di-GMP合成調控的驗證之後，我們將兩部分的工作整理在一起，並投稿到了Nature Chemical Biology，但因為缺乏共結晶結構的證據，Nature Chemical Biology沒有送審。隨後轉投到了Nature communications。在NC審稿過程中，碰到了最大問題是DgcZ的乙醯化化學計量學問題（acetylation stoichiometry, 即乙醯化比例）。我們通過AQUA實驗，測得DgcZ在體內的乙醯化比例是1.3%，所以我們很難說明這麼低的乙醯化比例怎麼引起體內和體外酶活的重大變化，這也成為我們和其中一個reviewer最大的爭論點（這一點好像是掉到陷阱裡了，因為研究表明大腸桿菌蛋白乙醯化比例平均為1%左右，而為什麼這麼低到現在為止其實並不清楚）。在經過三輪審稿後，我們最終未能說服最Tough的那個reviewer。當然在Nature communications的投稿過程中，我們也犯過一些錯誤，甚至是非常低級的錯誤，包括質譜數據描述的不一致，以及修改過程中的重視程度不夠等。
接著我們發現，乙醯化的DgcZ在體內容易發生沉澱，使得可溶的DgcZ蛋白量減少約50%，而這也部分的解釋了為什麼DgcZ蛋白的乙醯化比例低（因為我們測的是可溶的DgcZ蛋白，而乙醯化的DgcZ傾向於沉澱）。在補充了實驗之後，我們將文章投到了Molecular cell，順利送審。但最終的審稿意見較為負面，問題主要還是集中在生理上的相關性方面。雖然大腸桿菌沒有什麼太多生理的事情可以做，但這似乎是一個不能繞過去的問題。在這個時候，我們決定適當修改後投到The EMBO J，並同進行生理方面的實驗。基本與我們所料，The EMBO J審稿建議我們在更加接近生理條件的狀態下測定c-di-GMP對CobB的影響，的確我們在調整c-di-GMP與CobB的反應buffer之後，測得了更高的親和力。且利用抗生素刺激替代了蛋白過表達來提高體內c-di-GMP的濃度，以更加接近生理狀態的角度表明c-di-GMP對CobB的影響。最終文章經過一輪大修和一輪小修後順利接收。
很多時候，一篇文章從投稿到接收會經常經歷無數磨難，這項研究從開始實驗到投稿花了2年半時間，而從投稿到接收又經歷了2年3個月。在投稿過程中，確實審稿人的建議使得該項研究的證據更加充實，但有時候也要謹防掉「陷阱」。而不可否認的是，與審稿人進行多次的「鬥智鬥勇」也使我積累了寶貴的經驗。如果把整個過程作為一個機會，作為一種歷練，可以說是「為伊消得人憔悴，衣帶漸寬終不悔」。只有經歷這樣的過程，才能更上層樓。
英文摘要：
Interplay between the bacterial protein deacetylase CobB and the second messenger c-di-GMP
As a ubiquitous bacterial secondary messenger, c-di-GMP plays key regulatory roles in processes such as bacterial motility and transcription regulation. CobB is the Sir2 family protein deacetylase that controls energy metabolism, chemotaxis, and DNA supercoiling in many bacteria. Using an E.coli proteome microarray, we found that c-di-GMP strongly binds to CobB. Further, protein deacetylation assays showed that c-di-GMP inhibits the activity of CobB and thereby modulates the biogenesis of acetyl-CoA. Interestingly, we also found that one of the key enzymes directly involved in c-di-GMP production, DgcZ, is a substrate of CobB. Deacetylation of DgcZ by CobB enhances its activity and thus the production of c-di-GMP. Our work establishes a novel negative feedback loop linking c-di-GMP biogenesis and CobB-mediated protein deacetylation.
全文連結：https://doi.org/10.15252/embj.2018100948