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人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用
目的：本試劑盒用於測定人血清，血漿及相關液體樣本中細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152) 的含量。
實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152) 水平。用純化的人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152) 抗體包被微孔板，製成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152) ，再與HRP標記的細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152) 抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體複合物，經過徹底洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152) 呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152) 濃度。
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。
2. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
3. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘後，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反覆凍融，以使細胞破壞並放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其餘冷凍備用。
6. 標本採集後儘早進行提取，提取按相關文獻進行，提取後應儘快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於-20℃保存，但應避免反覆凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
注意事項：
1． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
2． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉汙染。
3． 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
5． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請最後乘以總稀釋倍數（×n×5）。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
試劑盒組成：
| 試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
| 說明書 | 1份 | 1份 |
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| 封板膜 | 2片（48） | 2片（96） |
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| 密封袋 | 1個 | 1個 |
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| 酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
| 標準品：2700ng/L | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 標準品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 | 1.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 酶標試劑 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
操作步驟
1. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然後在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然後從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻後從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻後從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻後從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋後各孔加樣量都為50μl，濃度分別為1800ng/L，1200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。
3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋後備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。
6. 溫育：操作同3。
7. 洗滌：操作同5。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
9. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鐘以內進行。
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關係數R值為0.95以上。
2.批內與批見應分別小於9%和11%
檢測範圍：
100ng/L -2000ng/L
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。