3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性

2020-11-28 中國教育裝備採購網

【材料和試劑】

（1）         反應細胞：CTLL-2，存活率應＞95%。

（2）         IL-2標準品：倍比稀釋為不同濃度。

（3）         待測樣品：倍比稀釋為不同濃度。

（4）         10% Fcs-RPMI-1640完全培養液

（5）         3H-TdR

（6）         96孔培養板，刻度吸管，毛細吸管，刻度離心管，離心機，加樣器（頭），細胞計數板，倒置顯微鏡，超淨工作檯，CO2培養箱，微量細胞收集儀，玻璃纖維濾紙，ß液閃計數儀。

【操作步驟】

（1）   用10 %FCS-RPMI-1640培養液洗滌CTLL-2細胞2次，1000r/min離心5min，以去除原生長培養液（含IL-2）；

（2）   用10% Fcs-RPMI-1640培養液調細胞濃度為1×105/ml；

（3）   將不同倍比稀釋度的IL-2的標準品和待測樣品分別加入96孔細胞培養板，100μL/孔，各設3復孔，同時設培養液對照；

（4）   各孔均加入CTLL-2細胞懸液，100μl/孔 ；

（5）   置37℃，5%CO2培養箱中培養24h；

（6）   每孔均加入3H-TdR，0.5μci/孔  ，繼續培養4-6h；

（7）   用微量細胞收集儀收集細胞於玻璃纖維紙上，用ß液閃計數儀測定各孔cpm值。測定CPM值的最佳時間應是培養液對照（無IL-2）細胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔細胞生長旺盛時。

【結果分析】

（1）         每孔cpm值為了復孔的平均值，再減去培養液對照，即為各孔最終c

（2）         計算IL-2活性單位（參見IL-1、IL-2的MTT比色檢測法）可按下式計算：

 

樣品IL-2活性單位

（U/ml）

=

達50%最大增殖3H-TdR滲入值的樣品稀釋度

×

標準品IL-2活性單位

（U/ml）

達50%最大增殖3H-TdR滲入值的標準品稀釋度

 

【注意事項】

（1）   用125I-UdR代替3H-TdR進行IL-2活性檢測。其優點是不需ß液體閃爍測定所需的試劑和設備，只需一臺小型γ計數儀即可，並可節省時間和減少ß液體閃爍操作中出現的誤差。其缺點是125I-UdR半衰期較短，需要定期供應。基本方法同3H-TdR摻入法，只是用125I-UdR代替3H-TdR，0.2μci/孔  ，然後再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl，繼續培養24h，收集細胞用γ計數儀測定cpm值。

（2）   其餘注意事項可參見MTT法檢測IL-2活性部分。

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