中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）是一種人畜共患病病毒，在人類中可引起嚴重且往往致命的呼吸系統疾病。目前研發的抗體治療主要集中在中和針對病毒棘突蛋白受體結合域從而阻斷受體結合。近日，荷蘭烏得勒支大學與荷蘭鹿特丹伊拉斯謨醫學中心、西班牙國家研究理事會等合作，在Emerging Microbes & Infections雜誌上發表了題為Towardsa solution to MERS: protective human monoclonal antibodies targeting dierent domains and functions of the MERS-coronavirus spike glycoprotein的研究論文，使用編碼人Ig可變區的轉基因H2L2小鼠篩選得到一組針對MERS-CoV的S蛋白不同區域且具有不同功能的人單克隆抗體，其中獲得的8個單克隆抗體分別針對MERS-CoV的S蛋白不同區域且具有不同功能，其識別的表位分別位於6個不同的表位區域，可以幹擾MERS-CoV棘突蛋白的三個關鍵進入功能：唾液酸結合、受體結合和膜融合；並且，這些抗體中，具有強的或弱的中和活性的抗體被動免疫小鼠後均能保護小鼠免受致死性MERS-CoV攻擊。這些抗體通過靶向不同的棘突蛋白表位和功能，為人類通過體液保護對抗新出現的MERS-CoV提供了新的途徑。
中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）是一種新興的人畜共患病病毒，可導致嚴重的、往往是致命的呼吸道疾病。自2012年沙烏地阿拉伯首次發現MERS-CoV以來，人感染MERS-CoV病例逐漸增加，截至2019年2月，共報告2298例，死亡率約為35%。目前尚缺乏治療或預防MERS-CoV感染的抗病毒療法或疫苗。
MERS-CoV病毒粒子表面的病毒棘突蛋白（S）是開發疫苗和抗體治療的主要抗原靶點，包含受體結合亞單位S1和膜錨定融合介導亞單位S2。單粒子的低溫電子顯微鏡分析結果顯示，S1亞單位由四個核心區域組成，其中，S1B結構域與細胞進入所必需的宿主受體DPP4結合，N端結構域S1A與黏液蛋白和宿主細胞表面的唾液多糖結合可增強MERS-CoV對人肺細胞的感染，三個S2亞基形成了穗狀花序的莖，可以經歷廣泛的構象變化，使膜融合成為可能，並且顯示處較S1亞單位更高程度的保守性。
很多方法被用於開發具有強中和活性的MERS-CoV人單克隆抗體，包括從MERS病人中分離單細胞培養記憶B細胞、使用編碼人IgG可變區的轉基因小鼠進行雜交瘤細胞融合、噬菌體或酵母展示系統等等。但是大部分獲得的S單抗都是針對MERS-CoV S1區域的受體結合區（RBD），結構功能分析表明這些抗體主要通過於DPP4結合位點重疊而發揮中和作用。目前報導的單抗中僅有兩株小鼠單抗針對RBD以外區域。儘管S1特異性的中和抗體在治療MERS-CoV感染中具有重要作用，但是，有效的抗體治療可能需要將中和抗體和非中和抗體相結合，針對多個表位、發揮多種作用機制。
1、針對MERS-CoVS蛋白不同區域的H2L2抗體的分離
為了獲得人源單克隆抗體，研究者使用H2L2轉基因小鼠，分別採用兩組策略免疫小鼠。方案一是將純化的MERS-S1或MERS-S保亞單位免疫小鼠；方案二是採用序貫免疫，依次免疫MERS-S和MERS-S2區域，以便產生針對較為保守的S2亞單位的抗體(圖1A)。結果顯示：針對免疫方案一，從4553孔中獲得針對與S1蛋白反應的陽性雜交瘤細胞113株，進一步表位分析發現，56%的抗體與S1B結合，38%的抗體與S1A結合，1%的抗體與S1C或S1D域結合，2%不與任何S1域結合；針對免疫方案二，從1158個雜交瘤上清中篩選得到能與MERS保外去結合的雜交瘤細胞50株。大多數與S1結合的MERS-S反應性抗體(84%)和8種(16%)與S2結合(圖1B)。假病毒中和試驗表明，針對S1區域的113株單抗中有40株具有中和活性且其表位都是針對S1B區域；針對S2區域的8株抗體中有2株具有中和活性。
Fig 1. Generation and characterization of monoclonal antibodies targeting the MERS-CoV spike protein.
2、8株MERS抗體的生物學特性研究
研究者從MERS-CoV S特異性H2L2抗體組中進一步篩選，獲得8個單克隆抗體分別命名為1.10f3, 7.7g6, 1.6f9, 1.2g5, 1.8e5, 4.6e10, 1.6c7, 3.5g6，這些抗體的表位分布於MERS-CoVS蛋白的不同區域。將這些抗體的輕、重鏈可變區基因克隆到人IgG1表達載體中，通過HEK-293T細胞表達和純化獲得人單克隆抗體，並對其生物學特性和功能進行進一步鑑定。
結合活性和親和力驗證結果顯示：通過可溶性MERS-CoV Secto、S1、S1A、S1B或S2ecto為抗原進行ELISA，證實mAb 1.10f3與唾液酸結合域S1A結合，mAbs 7.7g6、1.6f9、1.2g5、1.8e5、4.6e10與受體結合域S1B結合，而mAbs 1.6c7、3.5g6與膜融合亞單位S2區域結合 (圖2A)。競爭抑制試驗及結合動力學研究，顯示這8個抗體主要位於S蛋白六個不同的表位區域。並且這些抗體也能特異性結合細胞表面表達的MERS-CoVS蛋白相應區域。
中和活性驗證結果顯示：分別使用MERS假病毒和真病毒對這些抗體的中和活性和血凝抑制活性進行研究，結果顯示，針對MERS S1B區域的單抗7.7g6, 1.6f9和1.2g5顯示出最強的中和活性（I），IC50為pm級，1.8e5（II）和4.6e10（III）顯示出中等偏弱的中和活性，IC50為nm級；而針對S-1A區域的單抗1.10f3未檢測到中和活性（IV）；針對S2區域的1.6c7（V）和3.5g6（VI）顯示出一定的中和活性。
Fig 2. Human anti-MERS-S mAbs targeting six epitope groups distributed over multiple domains of the MERS-CoV spike protein.
Fig 3. Virus neutralization and receptor binding inhibition by anti-MERS-S mAbs.
3、8株MERS抗體的作用機制研究
S1B區域的單抗通過阻斷受體結合中和MERS-CoV。為了評估抗體是否能與病毒結合到宿主受體DPP4競爭，研究者建立了一種基於ELISA的受體結合抑制實驗，定量檢測MERS-S外域與DPP4包被的ELISA板的結合，並測量抗體對受體結合的幹擾作為結合信號的降低。基於ELISA的受體結合抑制實驗結果顯示，在沒有抗體的情況下，MERS-S外域與DPP4呈穩定的結合(圖3B)。抗MERS-S1B mAb 1.8e5對MERS外域與DPP4的結合幹擾較弱，而所有其他的MERS-S1B區域特異性單抗(7.7g6, 1.6f9, 1.2g5, 4.6e10)均對MERS 胞外區與DPP4的結合具有濃度依賴性的抑制作用(圖3B，表2)。這些結果表明，針對S1B區域的抗體通過與S1B受體結合位點部分重疊或結合距離足夠近，與受體結合形成競爭，說明這些抗體抑制病毒受體相互作用是其體外中和的主要機制。
1.10f3阻斷了MERS-S1A與唾液糖苷綴合物的結合。MERS-S1A結構域可以促進病毒與細胞表面唾液糖苷結合，而唾液糖苷結合可以作為MERS-CoV的細胞粘附因子。研究者lumazine synthase (LS)納米顆粒多價展示MERS-S1A (S1A-LS)用於MERS-S1A結構域進行的唾液酸依賴的血凝反應。將S1A-LS與紅細胞混合後觀察到血凝現象(圖4A)。在添加MERS-S1A mAb 1.10f3後，S1A-LS介導的血球凝集被抑制。研究者利用感染MERS-CoV的Vero細胞和Calu3細胞進性了進一步驗證。在不依賴於細胞表面的唾液酸Vero細胞中MERS的感染受影響，而在依賴於細胞表面唾液酸的Calu-3細胞中，可以觀察到1.10f3抑制Calu-3細胞感染，說明與MERS-S1A結合的抗體可以通過抑制病毒與細胞表面唾液多糖的結合來中和MERS-CoV感染(圖4)，表明靶向MERS-1A的單抗1.10f3的是否會干擾其與紅細胞表面唾液糖結合。
靶向S2的單抗感染MERS介導的膜融合。為了驗證MERS-S2亞基的抗體是否通過抑制融合中和MERS-CoV感染，研究者設計了一個基於MERS-CoV-S的細胞-細胞融合實驗。轉染表達DPP4的Huh-7細胞後，可以很容易地通過GFP信號觀察到這種MERS-S變體的表達。加入胰蛋白酶後，檢測到大的GFP，提示MERS介導的細胞-細胞融合(圖4C)。正如所料，由於細胞融合依賴於受體的相互作用，加入抗MERS-S1B(7.7g6)可阻斷合胞體的形成。MERS-S1A單抗1.10f3對合胞體的形成沒有影響。相比之下，MERS-S2特異性單抗1.6c7和3.5g6均阻斷合胞體的形成，由於這兩種中和抗體都不幹擾受體結合，推測這些S2特異性抗體通過阻止融合所需的MERS-CoV S蛋白S2亞基構象變化來抑制感染。
Figure 4. Anti-MERS-S mAbs targeting MERS-S1A and -S2 domains block domain-specic functions.
4、8株MERS抗體在小鼠體內的保護效果
為了評估這些單抗在體內對MERS-CoV感染的預防效果，研究者使用了表達人DPP4的轉基因K18-hDPP4小鼠。在MERS-CoV感染前6小時，將小鼠(5/組)腹腔注射50μg劑量mAb (1.8mg/Kg)。連續12天對監測小鼠的存活率和體重變化。結果顯示，對照組小鼠體重均顯著下降，且在感染後7至8天內死亡。與此相比，所有MERS-S1B結合的單抗體對致死性MERS-CoV具有較高的保護水平(80-100%，圖5)；MERS-S1A結合的mAb1.10f3提供了部分的保護(40%)；值得注意的是，抗MERS-S2單抗1.6c7和3.5g6的小鼠保護率達到了100%。這些結果表明，針對MERS S蛋白的非RBD的抗體可以增強對MERS-CoV感染的體液免疫提供保護。
Fig 5. Human anti-MERS-S mAbs protect mice against lethal MERS-CoV challenge.
本研究獲得的系列單克隆抗體針對MERS-CoV的S蛋白不同區域且具有不同功能，其識別的表位分別位於6個不同的表位區域，可以幹擾MERS-CoV棘突蛋白的三個關鍵進入功能：唾液酸結合、受體結合和膜融合；並且，非靶向RBD區域的弱的中和抗體也能保護小鼠免受致死性病毒攻擊。 研究證實了MERS S蛋白的保護性抗體表位存在於多個區域，提示基於多個結構區域的S蛋白的疫苗可能比聚焦於RBD的疫苗抗原提供更廣泛的免疫反應，並降低抗原逃逸的風險。本研究中發現的不同體液免疫反應與免疫保護的相關性，這也是未來疫苗評估值得考慮的地方。
ABSTRACT
The Middle-East respiratory syndrome coronavirus(MERS-CoV) is a zoonotic virus that causes severe and often fatal respiratory disease in humans. Efforts to develop antibody-based therapies have focused on neutralizing antibodies that target the receptor binding domain of the viralspike protein thereby blocking receptor binding. Here, we developed a set of human monoclonal antibodies that target functionally distinct domains of the MERS-CoV spike protein. These antibodies belong to six distinct epitope groups and interfere with the three critical entry functions of the MERS-CoV spike protein: sialic acid binding, receptor binding and membrane fusion. Passiveimmunization with potently as well as with poorly neutralizing antibodiesprotected mice from lethal MERS-CoV challenge. Collectively, these antibodies offer new ways to gain humoral protection in humans against the emerging MERS-CoV by targeting different spike protein epitopes and functions.
Ivy Widjaja, Chunyan Wang, Rien van Haperen, Javier Gutiérrez-lvarez,Brenda van Dieren, Nisreen M.A. Okba, V. Stalin Raj, Wentao Li, Raul Fernandez-Delgado, Frank Grosvel, Frank J. M. van Kuppeveld, Bart L. Haagmans,Luis Enjuanes, Dubravka Drabek and Berend-Jan Bosch. Towards a solution to MERS: protective human monoclonal antibodies targeting dierent domains and functionsof the MERS-coronavirus spike glycoprotein. Emerging Microbes& Infections 2019, VOL. 8.
https://doi.org/10.1080/22221751.2019.1597644.
本期編輯：Annabella
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