降低受體與蛋白結合力!我國科學家開發重組ACE2-Ig抗體,或可中和新...

在尚無特定的抗病毒治療或疫苗可用的情況下，新冠疫情仍然牽動著大眾的心。

一般而言，冠狀病毒（包括SARS和SARS-CoV-2）的棘突蛋白（S）與細胞受體結合，介導其靶細胞的感染。而血管緊張素轉換酶2（ACE2）是新冠病毒的有效受體——這種肽酶在腎素-血管緊張素系統（RAS）5中也起著關鍵作用。

近日，來自第二軍醫大學基礎醫學學院、上海交通大學醫學院和Pharchoice Therapeutics的研究人員們，通過將人體ACE2的胞外域連接到人免疫球蛋白IgG1的Fc區，來生成了重組的ACE2-Ig蛋白。這項研究中，他們還使用了包含具有低催化活性的ACE2突變體的融合蛋白，然後對其進行表徵。

近日，這項研究成果在線發表在Nature Communications上，題為「Neutralization of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus by recombinant ACE2-Ig」。

研究人員發現——這兩種融合蛋白，對新冠病毒的受體結合結構域具有高結合親和力，並且在小鼠中表現出良好的藥理性質。此外，融合蛋白可在體外「中和」掉那些模仿SARS-CoV或SARS-CoV-2的假病毒的刺突蛋白。

而且這些融合蛋白對冠狀病毒表現出交叉反應性，據此推斷它們在新冠病毒的診斷、預防和治療中具有潛在的應用。

在人和小鼠模型中顯示出rACE2高清除率

從輕度、自限性呼吸道疾病到嚴重的進行性肺炎，以及多器官衰竭和死亡——新冠病毒的感染和攻擊範圍很廣。

由於ACE2是激素級聯反應的關鍵參與者，在心臟腎功能的穩態控制中起著核心作用，因此研究人員進行了重組ACE2（rACE2）的藥效學研究，並確定了其預防嚴重的急性肺損傷和急性Ang II誘導高血壓的能力。

在小鼠模型中，rACE2的給藥也顯示出抑制心肌重塑的作用，並減輕了Ang II引起的心臟肥大和心臟功能障礙，以及腎臟的氧化應激、炎症和纖維化。而且，重組ACE2蛋白顯示出對新冠病毒具有治療潛力。然而，在人和小鼠中，rACE2的清除率均很高，藥代動力學研究顯示其半衰期僅有數小時。

最近，研究人員們通過實驗發現由鼠rACE2和Fc片段組成的融合蛋白（rACE2-Fc）在小鼠的血管緊張素II依賴性高血壓的急性和慢性模型中均具有保護器官的能力。有趣的是，融合蛋白也具有長效作用。

實驗顯示，與人免疫球蛋白IgG1的Fc區融合的人ACE2胞外域重組蛋白（稱為ACE2-Ig）與SARS-CoV的受體結合域（RBD）發生了高親和力結合。此外，ACE2-Ig在體外顯示出針對SARS病毒和新冠病毒的有效交叉反應。

結果

ACE2-Ig抗體的產生

基於ACE2對冠狀病毒的受體功能，研究團隊假設ACE2融合蛋白具有中和冠狀病毒，特別是新冠病毒（SARS-CoV-2）的潛力。為了進一步評估ACE2的治療潛力，他們設計並生成了由與人源IgG1的Fc域連接的人源ACE2的胞外域組成的融合蛋白（ACE2-Ig）（如補充圖1所示）。

圖1：ACE2-Ig的示意圖。

重組ACE2-Ig融合蛋白以同型二聚體形式存在，每個亞基由與人IgG Fc域連接的ACE2肽酶結構域組成。

這項研究中還使用了ACE2變體（HH / NN），其中兩個活性位點的組氨酸殘基（殘基374和378）已被更改為天冬醯胺殘基（asparagine residues），以降低催化活性。含有ACE2變體的融合蛋白——被稱為mACE2-Ig，按照特定方式進行表達和純化。融合蛋白對兩種冠狀病毒RBD的親和力，最後通過BIAcore結合測定法進行了確認，並且兩種融合蛋白均顯示出對RBD的高親和力。

該研究團隊先前的研究顯示，融合蛋白的變性溫度與Fc融合蛋白TIGIT-Ig的變性溫度相似，這表明了IgG樣的穩定性。在40 C下以1 mg ml-1的濃度保存1周後，他們觀察到高分子量和低分子量產物的最低濃度（<2％）。然後，研究人員測試了融合蛋白的藥代動力學（PK）參數。用單次靜脈內劑量的融合蛋白分別治療小鼠，並通過ELISA確定融合蛋白的血清濃度。結果表明，小鼠體內ACE2-Ig、mACE2-Ig和TIGIT-Ig的主要PK參數非常相似，證明了融合蛋白的高穩定性。

ACE2-Ig的中和作用究竟如何？

在確定ACE2融合蛋白以高親和力結合了RBD之後，研究人員們又尋求測試ACE2融合蛋白對新冠病毒（SARS-CoV-2）的抑制活性，並通過使用SARS-CoV和SARS-CoV-2的S糖蛋白假病毒，將其對SARS病毒的抑制活性進行比較。

數據表明，SAR2-CoV和SARS-CoV-2均被ACE2-Ig和mACE2-Ig有效中和。ACE2-Ig對SARS-CoV和SARS-CoV-2中和的IC50值分別為0.8和0.1μg/ ml-1。 mACE2-Ig對兩種病毒的中和作用的IC50值分別為0.9和0.08μg/ ml-1（圖2a）。此外，在A549細胞中，ACE2-Ig對SARS-CoV和SARS-CoV-2中和的IC50值分別為1.4和0.1μg/ ml-1。

mACE2-Ig對兩種病毒的中和作用的IC50值分別為0.6和0.03μg/ ml-1（圖2b）。沒有觀察到TIGIT-Ig中和的證據。

圖2：ACE2-Ig可以有效地中和用S糖蛋白假型化的病毒。

用來自冠狀病毒S糖蛋白假型化的HIV在感染前與不同的融合蛋白孵育1小時。測量靶293 T細胞（a）和A549細胞（b）中的螢光素酶活性，並計算中和百分比。數據為4個獨立的生物學複製品的平均值±標準差d。源數據（a，b）作為源數據文件提供。

之後，他們使用細胞融合測定法進一步表徵融合蛋白的體外中和作用（圖3）。 ACE2-Ig有效抑制SARS-CoV S蛋白介導的融合，IC50值為0.85μg/ ml-1，而SARS-CoV-2 S蛋白介導融合的IC50值為0.65μg/ ml-1。在相同的實驗條件下，另一種融合蛋白mACE2-Ig對SARS-CoV和SARS-CoV-2的IC50值分別為0.76μg/ ml-1和0.48μg/ ml-1。對照TIGIT-Fc在該測定中未顯示任何抑制作用。

圖3：ACE2-Ig抑制細胞融合。

SARS-CoV（左）或SARS-CoV-2（右）S糖蛋白介導了有效的細胞融合抑制作用。將表達不同S糖蛋白的細胞與所示融合蛋白一起孵育，並與表達ACE2的細胞混合。測定報告基因β-gal的活性作為融合的相關性。曲線代表與實驗數據的最佳擬合，並用於計算IC50值。通過表面等離振子共振（SPR）進行SARS-CoV S蛋白和SARS-CoV-2 S蛋白與ACE2-Ig結合的動力學分析。數據為4個獨立生物學複製品（a）的平均值±標準差d，所示結果代表3個獨立實驗（b）。源數據作為源數據文件提供。

這些數據表明ACE2-Ig和mACE2-Ig均表現出對SARS-CoV和SARS-CoV-2的有效抑制活性。在這兩種測定中，他們觀察到ACE2-Ig抑制SARS-CoV-2 S蛋白驅動的進入的效率，要高於抑制SARS-CoV S蛋白介導進入的效率。

接下來，他們還希望確定ACE2-Ig和nCoV S蛋白的結合動力學。與ACE2-Ig結合的SARS-CoV-2 S蛋白ACE2-Ig的親和力約為10 nM，比與ACE2-Ig結合的SARS-CoV S蛋白的親和力高約16倍（圖3b）。這個結果和他們此前的一項研究一致：SARS-COV-2刺突蛋白對ACE2-Ig的較高親和力，可能有助於明顯提高中和效率。

ACE2已被確定為治療心血管和腎臟疾病的重要藥物靶標。儘管ACE2是冠狀病毒感染的關鍵功能受體，但rACE2的半衰期短可能會阻礙rACE2蛋白的實際使用。而重組Fc融合體可以延長可溶性蛋白在血漿中的停留時間、提高體內功效，並獲得免疫反應功能，已被廣泛用於現代生物藥物中。

與凝血因子是血液駐留酶不同，全長內源性ACE2是錨定在細胞表面的跨膜蛋白，事實上，ACE2活性在全身循環中的含量非常低。因此，ACE2融合蛋白全身給藥的安全性考慮之一是它們可能具有全身性心血管副作用。有趣的是，最近的一份報告顯示，在用鼠類ACE2融合蛋白治療的小鼠中沒有會產生任何副作用的證據。

此外，這次研究的初步結果表明，當ACE2的兩個活性位點組氨酸殘基被修飾為天冬醯胺殘基時，ACE2的中和作用仍然存在。

新冠病毒在全球的迅速傳播突顯了對冠狀病毒疫苗和治療劑的迫切需求。儘管SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD之間具有較高的結構同源性，但大多數目前對SARS-CoV具有強力中和活性的人抗體——包括S230、m396和80 R，均未顯示與SARS-CoV-224的交叉反應。研究人員們提供的證據表明，可用ACE2-Ig中和SARS-CoV-2病毒是可行的潛在方案，但是——目前實驗中的體外功效模型基於偽病毒系統。

總而言之，此次實驗的數據，揭示了基於ACE2的策略治療新冠肺炎的潛力，該策略可單獨或組合使用。基於ACE2封鎖的分子機制，這些融合蛋白可能具有針對冠狀病毒的廣泛中和活性。這些ACE2融合蛋白也可用於診斷以及在疫苗和抑制劑開發中用作研究試劑。

實驗方法：

1）融合蛋白的產生

為了產生重組融合質粒，將ACE2的細胞外結構域（ECD）的DNA序列連接至人IgG1的Fc片段的DNA序列。突變是由合併DNA技術（Integrated DNA Technologies）產生的。研究人員們使用了pcDNA3.4載體和FreeStyle 293表達系統（Invitrogen）來表達融合蛋白。他們使用收穫的細胞來培養上清液，並使用蛋白A-瓊脂糖進一步純化融合蛋白。 TIGIT-Ig17被用作該項研究的對照。融合蛋白的濃度和純度，則分別通過測量280nm處的UV吸光度和聚丙烯醯胺凝膠電泳來確定。

2）親和力測試

固定在CM5晶片（150 RU）上的抗人Fc多克隆抗體（Jackson ImmunoResearch，109-005-008）用於捕獲融合蛋白，然後注射CoV RBDs26（12.5（nM–200 nM）。空白流通細胞用於校正結合反應。表面等離子體激元共振（SPR）方法與BIAcore 2000一起使用以測量融合蛋白的單價結合親和力，並使用同時適合ka和kb的1：1 L模型進行動力學分析。

3）藥代動力學測試

第二軍醫大學機構動物護理和使用委員會（IACUC）批准了體內實驗，並將小鼠飼養在特定的無病原體屏障設施中。他們使用BALB / c小鼠確定融合蛋白的藥代動力學特徵。八周大的小鼠（中國科學院上海實驗動物中心）通過尾靜脈注射給予融合蛋白，劑量為5μmg/ kg體重。將小鼠分為15組，對應於第1-15天。在含肝素的試管中從隔墊中收集血液，然後離心去除血細胞並獲得血漿樣品。通過ELISA測定融合蛋白的血清濃度。

4）偽病毒中和試驗

293T細胞和A549細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC，馬納薩斯，維吉尼亞州）。然後通過STR分析驗證細胞系的身份，並確認該細胞系不含支原體。之後將細胞用10％胎牛血清保持在DMEM或1640中。細胞培養基和補充劑則購自Life Technologies。在研究中，研究團隊採用了完善的偽病毒中和系統。此測定法靈敏且定量，可在2級生物安全設施中進行。製備了包含各種病毒的S糖蛋白的偽病毒和編碼螢光素酶的缺陷HIV-1基因組作為報告蛋白，在轉染後48小時收穫了含有SARS-CoV或SARS-COV-2偽病毒的上清液，用於單周期感染ACE2轉染的293T和A549細胞（293T / ACE2和A549 / ACE2）。將含有假病毒的上清液與連續稀釋的融合蛋白在37°C下預孵育1μh，然後添加到細胞中。培養物在24小時後用新鮮培養基重新培養，再孵育48小時。螢光素酶活性根據製造商的說明（Promega）進行測量。

5）細胞融合抑制試驗

基於β-半乳糖苷酶（β-gal）作為特定基因的定量細胞融合測定，用於評估融合蛋白的中和活性。轉染了指示的CoV S糖蛋白基因的293T細胞在室溫下與不同的融合蛋白預孵育15分鐘，與293 T / ACE2細胞以1：1的比例混合，並在37°C孵育4小時。 然後裂解細胞，並測量β-gal活性。 融合過程中的蛋白質濃度用於計算IC50值，IC50值定義為β-gal活性降低50％時的濃度。

編譯/前瞻經濟學人APP資訊組

原文來源：https://www.nature.com/articles/s41467-020-16048-4

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