關於:口腔支原體、肺炎支原體的標準品如何應用

2020-12-05 騰訊網

國藥典規定：「主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞進行支原體檢查時，應同時進行培養法和指示細胞培養法(DNA染色法）。病毒類疫苗的病毒收穫液、原液採用培養法檢查支原體。」本文締一生物為您分析關於：口腔支原體、肺炎支原體的標準品如何應用。

培養法所用的支原體培養基，在使用前需進行靈敏度檢查，這時需要用到國家藥品檢定機構分發的肺炎支原體（ATCC 15531株）和口腔支原體（ATCC 23714株）。在指示細胞培養法中，它們還可作為陽性對照。

在國際上，支原體核酸擴增技術（PCR/qPCR）由於具有操作簡單、節約時間、靈敏度高、特異性強等優勢，越來越多地用於製藥工業的支原體檢查。但如要替代培養法，其靈敏度需達到10CFU/ml；如要替代DNA染色法，其靈敏度需達到100CFU/ml，以防止發生漏檢。

為驗證支原體PCR/qPCR法的靈敏度，德國MB公司提供滅活支原體的靈敏度標準品，經過10CFU或100CFU嚴格標定，可用於支原體核酸擴增法的方法驗證。

一、產品信息

口腔支原體與肺炎支原體標準品的應用

口腔支原體與肺炎支原體標準品的應用

二、產品特點：

1. 支原體株來自英國菌種保藏中心NCTC。

2. 傳代次數少，支原體無變異。

3. 產品為凍乾粉，保證其穩定性。

4. 分析證書（COA）提供該批次GU：CFU比值（支原體基因組/菌落數比值）。

5. 支原體已滅活，保障細胞實驗室安全。

三、操作步驟

步驟1. 離心，收集標準品凍乾粉至管底。

步驟2. 每個管中添加1ml你的樣品基質。

步驟3. 室溫孵育5分鐘。

步驟4. 渦旋振蕩10秒，在離心10秒。

步驟5. 繼續DNA抽提。推薦使用德國MB公司提供的支原體DNA提取試劑盒（英文名：VenorGeM Sample Preparation Kit，貨號56-1010/-1050/-1200）。

步驟6. 抽提的DNA用於PCR/qPCR擴增。

我國《CAR-T細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》支原體檢查部分指出：

「選用商品化的檢測試劑，在使用前也需確認其最低檢出限不低藥典方法。在早期使用時，應與藥典方法平行進行，在獲得充分的比對數據後才有可能替代藥典方法。」

以往已有肺炎支原體和口腔支原體標準菌株，用於培養法的靈敏度檢查。但對於PCR/qPCR支原體核酸檢測法，國內尚沒有用於靈敏度驗證的支原體菌株標準品。德國MB公司長期專注支原體產品的開發和支原體的防控，具有二十多年的經驗，其所提供的10CFU和100CFU支原體靈敏度標準品被國際各大藥廠廣泛使用，很好地彌補了這一空白，使得核酸檢測法與培養法可以平行開展和比較結果，有助於對核酸檢測法進行方法驗證，為廣大藥廠帶來了方便。

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  • 不可小看支原體汙染問題
    但其實，更嚴重的是支原體 的感染，它的發生率非常高，而且不易被發現。不僅普通光鏡下無法發現支原體，而且培養基也不容易變色。只有在汙染的後期培養基才容易變黃。下圖為支原體嚴重汙染後的表現：那麼，支原體汙染為什麼發生率這麼高？
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    支原體汙染普遍存在，據美國數據統計，細胞發生支原體汙染的機率在70%以上。同時，由於支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到，不易被實驗者肉眼發覺，支原體汙染逐漸成為一個普遍存在的問題。本文締一生物為您分析細胞培養：關於支原體汙染的危害。
  • 同樣是細胞被支原體汙染，怎麼挑選支原體祛除劑
    養細胞時，除了支原體的檢測需要定期進行外，支原體的預防和祛除也是一個重要方面。它包括工作區域中的支原體的預防和祛除和培養箱水槽、水浴鍋中預防支原體的汙染。但一旦發生細胞培養時有支原體汙染，應如何挑選支原體祛除劑呢？這裡指的支原體祛除劑，是加入到細胞培養基中來發揮作用。德國MB有三種支原體祛除劑，都是加入到細胞培養基中使用。它包括：1.
  • 支原體汙染的影響是什麼?如何應對呢?
    細胞培養過程中，由於實驗環境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細胞發生支原體汙染的頻率很高。據美國數據統計，細胞發生支原體汙染的機率在70%以上。同時，由於支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到。因此，支原體汙染不易被實驗者肉眼發覺。而支原體汙染是個循序的過程，普通抗生素對其無效。
  • 如何有效把支原體汙染趕出你的細胞?
    對於已耗費很多時間、大量擴增起來的細胞，或經過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞，如果發現細胞被支原體汙染了，怎麼辦？本文締一生物為您分析如何有效把支原體汙染趕出你的細胞？ 由於前期工作量巨大，我們無法丟棄已有細胞。
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    近日《動物醫學進展》上有一篇文章《支原體對細胞培養汙染的研究概況》（動物醫學進展，2013,34：112-117）談到 「支原體汙染細胞的嚴重性」，裡面提到： 支原體最早發現於1898年，1956年Robinson等首次從細胞培養物中分離出支原體，之後國內外關於支原體汙染細胞的報導屢見不鮮。