科普：支原體標準品在核酸法驗證中的應用

2020-11-01 上海威正翔禹生物

支原體核酸法是通過檢測支原體的特異核酸序列，以確定細胞上清或生物製品中是否存在支原體汙染的一種方法。本文締一生物為您分析科普：支原體標準品在核酸法驗證中的應用。

由於它具有檢測時間短（只需3-4h）、操作便捷等特點，越來越受到生物製品企業的青睞。

支原體核酸法包括PCR和qPCR，可作為藥典規定的培養法或DNA染色法的替代方法，或與以上方法相互補充。事實上，早在2011年，就有動物疫苗廠家在2011年第5期的《廣東農業科學》上，報導了用德國Minerva Biolabs（簡稱MB）公司的支原體PCR試劑盒，用於檢測疫苗中是否存在支原體的汙染，它可與培養法互為補充，共同用於生產，為生產提供可靠的數據支持。

但支原體核酸法在用於放行檢測之前，需先進行方法驗證。歐洲藥典和日本藥典均要求核酸法需要在靈敏度、特異性和耐用性三個指標方面達到要求。

例如，在靈敏度方面（又稱最低檢測限），要求核酸法替代培養法，則靈敏度需達到10CFU/ml；核酸法替代DNA染色法，則靈敏度需達到100CFU/ml。

科普：支原體標準品在核酸法驗證中的應用

在特異性方面，歐洲藥典和日本藥典要求，核酸法要識別指定的常見9種支原體，而不識別與支原體有近緣關係的菌屬，如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳桿菌和肺炎鏈球菌，也不識別其他細菌和哺乳動物DNA。

在耐用性方面，歐洲藥典要求檢測結果不受方法參數的小的偏差的影響，如濃度的變化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步驟的細微差別等。實際上這是強調結果的可靠性和穩定性，不受人為操作誤差的影響。這可通過3輪不同時間段內的檢測來實現，每輪進行8次重複檢測，最後觀察結果有什麼變化。

在進行方法驗證時，參比標準品是必不可少的。世界著名微生物防控專家德國MB公司提供有一系列的支原體標準品和支原體DNA標準品，用於支原體核酸法的方法學驗證。

科普：支原體標準品在核酸法驗證中的應用

圖. MB公司提供的10CFUTM支原體套裝

MB提供的標準品有三類：一類是靈敏度標準品，它同時也用於耐用性驗證。該標準品為凍乾粉型的滅活支原體，這樣不會造成實驗室汙染。原支原體來自英國NCTC菌種保藏中心，由於傳代次數低，也很少發生突變。支原體經標準定量，有10CFU/管和100CFU/管可選。使用時用1ml與待測樣本同樣的基質液去溶解。之後進行支原體DNA抽提，再進行核酸法檢測。如結果陽性，則表明最低檢測限能達到上述標準。

MB公司第二類標準品為特異性驗證用標準品，它包括支原體基因組DNA以及細菌基因組DNA，種屬經測序驗證。該標準品為10ng左右包裝，為凍乾粉型。

第三類標準品是經過嚴格定量的支原體DNA標準品，每管支原體基因組DNA的量為1×108基因組拷貝，用於10倍梯度稀釋製備標準曲線，以對核酸法（主要是qPCR）的檢測限進行精確定量，並可驗證標準品濃度對數與Ct值的線性關係。

科普：支原體標準品在核酸法驗證中的應用

圖. 肺炎支原體DNA的定量。模板DNA的範圍為2X105-2個拷貝數基因組

值得指出的是，歐洲藥典和日本藥典均要求先進行支原體DNA抽提，再進行核酸法檢測。因此，方法驗證實際上包括了核酸法的這兩部分。

對於生物製品、細胞治療產品的生產企業，在選用已經過廠家全面驗證的支原體檢測試劑盒之外，還需自己按照待測樣本類型進行方法的適用性驗證。因為試劑盒的驗證並不能代替包括操作過程在內的方法的適用性，操作、樣本基質和儀器同樣會對核酸法的技術指標產生不可忽視的影響

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