支原體參比標準品為什麼對製藥工業的方法驗證十分重要

以PCR為代表的核酸擴增技術（簡稱NAT）自1988年發明以來，已廣泛應用於科研和臨床，但用於生物製藥則較晚，這是因為標準化的建立需要一定的時間。

我國藥典2020版《前言》指出：要「緊跟國際前沿，不斷擴大成熟檢測技術在藥品質量控制中的推廣和應用，檢測方法的靈敏度、專屬性、適用性和可靠性顯著提升，藥品質量控制手段得到進一步加強。如新增聚合酶鏈式反應（PCR) 法、DNA 測序技術指導原則等，推進分子生物學檢測技術在中藥飲片、動物組織來源材料、生物製品起始材料、微生物汙染溯源鑑定中的應用。」

在支原體檢查方面，藥典2020版在《通則3301 支原體檢查法》中也指出，除了培養法和指示細胞培養法（DNA染色法），「也可採用經國家藥品檢定機枸認可的其他方法。」實際上這裡的其他方法，就包括分子生物學方法（如NAT）。

2018年6月發布的《CAR-T細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》指出：

「由於藥典支原體檢查時間較長，因此也鼓勵研究者開發快速的支原體檢查法用於中間過程監測或放行檢測，但在臨床試驗過程中必須對快速方法進行充分的驗證，驗證方法可參考中國藥典的相關規定及國際要求，證明所用快速方法的最低檢出限至少不能低於藥典方法。即使選用商品化的檢測試劑，在使用前也需確認其最低檢出限不低藥典方法。在早期使用時，應與藥典方法平行進行，在獲得充分的比對數據後才有可能替代藥典方法。」即規定了建立支原體快速檢查方法的一般原則。

2018年8月，我國藥品監管部門還在《支原體檢查的核酸檢測方法及方法學驗證的思考》一文（見《中國藥事》第 8期）中，討論了方法驗證和標準支原體菌株的應用：

「開展支原體NAT方法學最低檢出限驗證需要2個關鍵元素的支持：

1）需要有正確鑑定的不同種類的支原體菌株，……；

2）這些菌株需要經過標化，即將支原體菌株製備分裝後，通過準確的支原體菌落計數或基因拷貝數定量對驗證用的支原體菌株樣本進行標化。目前，國際上有相關機構可提供這樣標定好的支原體菌株。」

目前，就筆者所知，德國MB（全稱Minerva Biolabs）即提供有這樣標定好的支原體菌株和支原體基因組DNA（拷貝數已經標定）。

在國際上，歐洲藥典2007年版即提到支原體NAT法可替代藥典方法，但需要進行驗證，並提到使用參比標準品。美國藥典和日本藥典也先後承認可使用驗證後的NAT法。

事實上，德國MB提供的支原體PCR和qPCR經典法試劑盒已經過MB公司自己的全面驗證，如使用MB公司的試劑盒，只需要再做樣本基質適用性的驗證。在驗證中，檢測限的驗證是主要內容之一。歐洲藥典指出，核酸擴增法如替代藥典規定的培養法，其檢測限需達到10CFU/ml，如替代指示細胞培養法，檢測限需達到100CFU/ml。也可通過核酸拷貝數確定檢測限，但應提前建立CFU與核酸拷貝數之間的換算關係。

德國MB即提供有標定過的10CFU/管和100CFU/管的支原體菌株。菌株均來自英國菌種保藏中心（NCTC），具有ATCC編號。為避免給實驗室帶來汙染，支原體已經過滅活，並且為凍乾粉形式，性能穩定。MB公司提供的支原體菌株有：萊氏無膽甾原體（A. laidlawii）、發酵支原體（M.fermentans）、豬鼻支原體（M. hyorhinis）、口腔支原體（M. oral）、精氨酸支原體（M. arginini）、肺炎支原體（M. pneumonia）雞毒支原體（M. gallisepticum）、滑液支原體（M. synoviae）、螺原體（Spiroplasma citri）、唾液支原體（M. salivarium），每種支原體靈敏度標準品都提供有CFU與GC（基因組拷貝數）的換算數值（每個批次均不同，詳見質控證書）。

表：MB生產的歐洲藥典列出的10CFU™支原體滅活菌株

德國MB還提供有經過精準定量的支原體基因組DNA，每管1×108拷貝數，梯度稀釋後可用於確定檢測限，制定標準曲線。

圖. 肺炎支原體DNA定量標準品梯度稀釋後的擴增曲線。DNA的量為2X105——2個拷貝。

MB還提供有用於特異性驗證的支原體基因組DNA以及細菌基因組DNA。

另需注意：按照國外藥典，支原體菌株和樣品需經支原體DNA抽提後，才能進行PCR檢測。因此，選擇合適的支原體DNA提取試劑盒也是需要考慮的因素。

事實上，我國藥典對標準品和參考品均有嚴格的界定。（見《中國藥典·生物製品國家標準物質製備和標定》）這裡所說的參比標準品，系迻譯自歐洲藥典的叫法。或可稱之為支原體參比物質樣本。