近日，普林斯頓大學的José L. Avalos團隊在《Nature Chemical Biology》上發表了題為「Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production」的文章，介紹了使用藍光就能控制IPTG誘導型啟動子基因表達的OptoLAC調控，並將其應用於異丁醇、甲羥戊酸合成以及重組蛋白YFP和FdeR的表達。
在2012年，發表在《Journal of Molecular Biology》上題為「From Dusk till Dawn: One-Plasmid Systems for Light-Regulated Gene Expression」的文章報導了pDawn質粒上的YF1 / FixJ系統，pDawn系統源自工程化的藍光響應性光傳感組氨酸激酶YF1及其同源響應調節劑FixJ（來自Bradyrhizobium japonicum），在黑暗中，YF1使FixJ磷酸化，然後激活PFixK2啟動子以表達λ噬菌體阻遏物cI，該阻遏物反過來阻止其同源P R的轉錄啟動子，控制感興趣的基因。而藍光可以誘導YF1的磷酸酶活性，從而抑制目的基因表達。
圖1 OptoLAC電路使用pDawn系統控制lacI表達
在本研究中，作者將lacI置於pDawn中cI控制的P R啟動子下，將目的基因置於IPTG誘導型啟動子下，以實現用光的轉變替代IPTG誘導。首先用GFP測試發現，在黑暗與明亮的條件下並不會導致表達產生顯著差異，需要進一步的優化。GFP誘導的誘導性差和總體水平較低，表明該菌株中的LacI水平過高，於是作者通過融合C端降解標籤來縮短lacI半衰期，C端降解標籤來自SsrA RNA，最後的三個胺基酸不同導致強度不同：SsrA-LAA， SsrA-AAV和SsrA-ASV。使用最強的SsrA-LAA標籤可在黑暗中產生最高的GFP表達。但是，SsrA-AAV標籤在藍光下提供了對基因表達的更嚴格控制，繼續使用LacI與SsrA-LAA和SsrA-AAV的融合體，將它們命名為OptoLAC1和OptoLAC2。為了減少OptoLAC2的洩漏，將LACO引入PFixK2啟動子中，控制表達的CI。通過這種設計，LacI可以抑制目的基因和控制其自身表達的cI阻遏物的轉錄，從而產生一個正反饋環，加強了電路的抑制作用，得到OptoLAC3。
圖3 OptoLAC1、2、3以GFP作為目的基因的控制效果
隨後，作者測試了OptoLAC的各種特性，分別在不同光佔比、不同的IPTG誘導型啟動子、不同的培養基下測試了OptoLAC的性能以及與IPTG誘導效果的對比。儘管與IPTG誘導的對照相比，包含OptoLAC迴路的菌株的滯後期略有增加，但它們在指數期和最終生物量產量方面顯示出可比的增長速度，終仍能趕上甚至超過IPTG達到的誘導水平，對細胞生長的影響極小。
鑑於光遺傳學在代謝工程應用上的潛力，作者測試了將OptoLAC用於異丁醇和甲羥戊酸的生物合成中，把OptoLAC電路控制的發酵從亮光轉換為黑暗時的OD600定義為ρs。用OptoLAC1和OptoLAC3控制IPTG誘導型啟動子下異丁醇的合成途徑，在最佳條件下，分別獲得2.5±0.1g/L和2.4±0.2 g/L的產量；用OptoLAC1和OptoLAC2控制IPTG誘導型啟動子下的甲羥戊酸合成途徑，在最佳條件下，分別獲得 6.4 ± 0.2 g/L和6.1 ± 0.2 g/L的產量。
圖5 OptoLAC用於異丁醇（左）和
甲羥戊酸（右）的生物合成
此外，為了證明OptoLAC電路在其他應用中具有控制LacI調控（IPTG誘導型）啟動子的能力，作者進行了重組蛋白生產的光控制測試。將OptoLAC1、2優化成適用於蛋白質生產的OptoLAC1B和OptoLAC2B，OptoLAC1B可以在光線下將YFP抑制，在黑暗中誘導。儘管OptoLAC1B在可檢測的蛋白質生成中顯示了約2小時的延遲，但在9-12小時的黑暗誘導後，由OptoLAC1B實現的蛋白質生成水平可與IPTG誘導的對照實現的水平相當。選擇轉錄因子FdeR（來源於Herbaspirillum seropedicae）作為重組蛋白生產的第二個例子，儘管延遲了約2小時，但誘導後9-12小時，用OptoLAC2B產生的FdeR與IPTG誘導的對照相當。
OptoLAC電路具有強大的功能，可以用光控制大腸桿菌中的基因表達，以黑暗條件作為誘導方式替代IPTG的功能，在代謝工程和重組蛋白表達的應用中可行，為用光代替IPTG開闢了廣闊的前景。
整理人：項紫蕾
文章連結：
https://doi.org/10.1038/s41589-020-0639-1