圖片來自Science, doi:10.1126/science.aao0100
2017年8月16日/
生物谷BIOON/---在原核生物的III型CRISPR-Cas系統中，多種Cas蛋白與CRISPR RNA（crRNA）組裝在一起形成Csm（對III-A型CRISPR-Cas系統而言）或者Cmr（對III-B型CRISPR-Cas系統而言）效應複合物，Csm或Cmr複合物通過一種轉錄依賴的DNA沉默來幹擾入侵的核酸。在噬菌體感染細菌之後，它的DNA開始轉錄，以便建立和維持感染周期。在
細菌中，這種crRNA引導的Csm/Cmr複合物作為一種監控複合物掃描入侵者的RNA中的互補性靶序列，即前間隔序列（protospacer）。crRNA引導Csm/Cmr結合到入侵者的RNA上，從而觸發Csm3/Cmr4亞基切割這種RNA，並且同時激活Cas10亞基的單鏈DNA酶活性，從而降解轉錄泡（transcription bubble）中的單鏈DNA。Csm或Cmr複合物通過檢查crRNA 5』-柄與RNA靶序列的3』端側邊序列之間的互補性來避免
自身免疫反應。crRNA 5』-柄與噬菌體的靶RNA存在鹼基配對會抑制Cas10的單鏈DNA酶活性，因而保護宿主DNA不被降解。crRNA 5』-柄與噬菌體的靶RNA不存在互補性會表明轉錄泡中的單鏈DNA是非自我DNA模板，從而激活Cas10的單鏈DNA酶活性，將它降解。
Cas10亞基在III-A型CRISPR-Cas系統中也被稱作Csm1，在III-B型CRISPR-Cas系統中也被稱作Cmr2。它含有一個N末端HD結構域，兩個小的α螺旋結構域和兩個Palm結構域。這兩個Palm結構域都具有一個鐵氧化還原蛋白類似的摺疊（ferredoxin-like fold），而且這個摺疊區域具有核酸聚合酶和核苷酸環化酶的核心結構域。在體外，Cas10的HD結構域負責降解單鏈DNA。人們猜測在一個Palm結構域中的保守性GGDD基序會產生環核苷酸（cyclic nucleotide），但是它的作用並未得到證實。來自強烈熾熱球菌（Pyroccocusfuriosus）的Cas10（以下稱PfCas10）獨自時和與Cmr3結合在一起時的晶體結構表明一個ADP、一個3』-AMP或兩個ATP可結合到Palm結構域中的GGDD基序和P環基序的胺基酸殘基上。這種腺嘌呤結合口袋的保守性提示著Cas10的Palm結構域可能具有酶活性，但是這種活性的性質是未知的。
為了解決這個問題，在一項新的研究中，來自立陶宛維爾紐斯大學的研究人員研究了嗜熱鏈球菌（
Sterptococcus thermophilus）III-A型CRISPR-Cas系統中的Cas10（以下稱StCas10）是否具有ATP依賴的催化活性。他們通過生化反應實驗證實在嗜熱鏈球菌Csm（以下稱StCsm）複合物中，Cas10亞基的GGDD基序負責將ATP轉化為一種未知的反應產物X，而且這種反應依賴於Mn
2+, Co
2+或Zn
2+，此外也較低程度地依賴於Mg
2+或Fe
2+。當然最為關鍵的是，這種反應特別依賴於靶RNA識別和crRNA 5』-柄與靶RNA的3』端側邊序列之間的非互補性。
為了確定反應產物X的身份，這些研究人員利用聚丙烯醯胺凝膠電泳、HPLC和質譜技術證實反應產物X是一種環寡腺苷酸（cyclic oligoadenylate, cOA）混合物，其中環三腺苷酸（cA3）是主要的產物。這就表明作為對病毒核酸入侵作出的反應，在StCsm複合物中，Cas10亞基的GGDD活性位點催化cOA合成。鑑於基於核苷酸的
小分子化合物，如cAMP、cGAMP、p
2Gpp、p
3Gpp和NAADP，在多種有機體中作為信號分子發揮作用，他們猜測這些cOA也可能是原核生物的抗病毒防禦通路中的信號分子。考慮到這些基於核苷酸的信號分子通常結合到傳感蛋白（sensory protein）上，他們也想要鑑定出cOA的傳感蛋白。
很多CRISPR-Cas系統與似乎並不直接參與間隔序列獲得、CRISPR轉錄本加工或幹擾入侵性核酸的蛋白結合在一起，其中最為常見的是Csm6/Csx1蛋白。嗜熱鏈球菌的III-A型CRISPR-Cas位點編碼兩個Csm6同源物：StCsm6和StCsm6』，不過它們都不是這個StCsm複合物的一部分。這兩個同源物具有保守的Csm6結構：N末端的CARF結構域，接著是α-螺旋區域和C末端的HEPN結構域。分子建模揭示出StCsm6和StCsm6』的CARF結構域核心區最類似於嗜熱棲熱菌（
Thermusthermophilus）Csm6蛋白（TtCsm6）的相應結構域。屬於HEPN超家族的結構域經常表現出RNA酶活性。
為了理解Csm6蛋白在嗜熱鏈球菌CRISPR-Cas免疫系統中的作用，這些研究人員發現StCsm6和StCsm6』表現出不依賴於金屬離子的單鏈RNA（ssRNA）降解活性，而且這種降解活性依賴於保守的HEPN活性位點上的胺基酸殘基：RXXXXH。顯著的是，它們的ssRNA降解活性是較弱的，僅在較高的蛋白濃度（微摩爾範圍）下才是明顯的。他們猜測StCsm複合物產生的cOA可能作為StCsm6和/或StCsm6』的CART結構域的配體發揮作用。他們首先證實cOA混合物顯著地增加StCsm6和StCsm6』的單鏈RNA酶活性，降低所需的蛋白濃度大約1000倍，而且它們不能夠降解雙鏈RNA（dsRNA）和單鏈DNA（ssDNA），這意味著它們是ssRNA特異性的核酸酶。此外，通過開展一系列實驗，他們證實StCsm6和StCsm6』的CARF結構域作為StCsm複合物產生的cOA配體的傳感蛋白發揮作用。
為了確定哪種cOA是StCsm6和StCsm6』的激活物，這些研究人員開展核酸酶測試，結果揭示出在所有測試過的cOA中，僅cA6（環六腺苷酸）激活StCsm6和StCsm6』的RNA酶活性。有趣的是，是cA4（環四腺苷酸）而不是cA6激活TtCsm6的RNA酶活性。在相同的反應條件下，線性的寡腺苷酸並不激活StCsm6或TtCsm6。這似乎表明cOA是多種III型CRISPR-Cas系統中通用的信號分子。這一發現提示著Csm6/Csx1和與Csm/Cmr複合物結合的其他CARF家族蛋白可能是由cOA調節的。
總之，這項研究揭示出原核生物免疫防禦系統中的一種基於cOA的信號通路。這些研究人員證實當結合到靶RNA上時StCsm6合成出的cOA作為第二信使，結合到Csm6的CARF結構域上，激活Csm6的RNA酶活性，從而激活非特異性的RNA降解。當Csm複合物對有轉錄活性的DNA和它的轉錄本的協同降解不能夠抵抗病毒時，這種信號通路可能作為應急措施發揮作用。不過不能確定的是cOA是否也能夠作為進行細胞間通信的胞外信使發揮作用。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Migle Kazlauskiene, Georgij Kostiuk, Česlovas Venclovas et al. A cyclic oligonucleotide signaling pathway in type III CRISPR-Cas systems. Science, 11 Aug 2017, 357(6351):605-609, doi:10.1126/science.aao0100Gil Amitai, Rotem Sorek. Intracellular signaling in CRISPR-Cas defense. Science, 11 Aug 2017, 357(6351):550-551, doi:10.1126/science.aao2210